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分子生物学教案模板(共8篇)

来源:三月飞鸣网    时间:2021-07-24




分子生物学教案

第一章 绪 论

本单元或章节的目的与要求

主要介绍分子生物学定义、研究内容和发展简史及未来发展方向等。 授课主要内容及学时分配 2 学时 第一章 绪 论

1.分子生物学定义:是研究核酸等生物大分子的形态、结构、功能、及其重要性和规律性的科学,是人类从分子水平上真正揭开生物世

界的奥秘,由被动地适应自然界转向主动地改造和重组自然界的基础学科。

分子生物学主要研究核酸在细胞生命过程中的作用,包括核酸本身的复制、保存以及基因的表达与调控规律,所以,这门学科其实应该

叫做核酸生物学( biology of nucleic acid )。

2.生物学大事年表 1859 年达尔文出版《物种起源》,提出了自然选择原则。但他无法解释生物

为什么能将性状遗传给下一代。

1865 年孟德尔通过他的豌豆发现了统一规律和分离规律。( Gregor Mendel,18221884 ) : 遗传学的奠基人

1869 年米歇尔 (Friedrich Miescher) 分离出核酸。

1879 年弗莱明 (Walter Flemming) 发现染色体,并描述了细胞分裂过程中染色体的行为。 1900 年孟德尔的成果被重新发现。

1903 年萨顿 (Walter Sutton) 发现染色体是成对的,并携带遗传信息。

1905 年加洛德 (Archibald Garrod) 提出了人类先天代谢疾病的概念,这是人类自身遗传研究的开始。

1911 年摩尔根(Thomas Hunt Morgan)提出基因学说,阐释基因在染色体上的分布,以及繁殖过程中染色体重组形成独特新个体的过程。

1913 年斯特提万特 (Alfred Henry Sturtevant) 绘制出第一张线式基因图谱。 1928 年格里菲斯 (Frederick Griffith) 发现了一种可以在细菌之间转移的遗传分子。 1929 年列文 (Phoebus Levene) 提出 DNA 的化学成分和基本结构。

1944 年 Oswald Avery, Colin Macleod 和 Maclyn McCarty 指出, Griffith 发现的遗传分子就是 DNA 。

1948 年鲍林 (Linus Pauling) 提出蛋白质为螺旋形的理论。

1950 年查加夫 (Edwin Chargaff) 发现核酸中四种碱基的含量比例是一定的。 1951 年富兰克林 (Rosalind Franklin) 拍摄到了核酸的 X 射线衍射照片。

1952 年 Alfred Hershey 和 Martha Chase 利用病毒证实,传递遗传信息的是 DNA 而不是蛋白质。赫尔希也由于这一研究而荣获 1969 年的诺贝尔医学生理学奖。

1953 年沃森 (James Watson) 和克里克 (Francis Crick) 在《自然》杂志上发表 DNA 双螺旋结构的论文。 J.Watson ,美国冷泉港研

究所科学家; F.Crick ,英国剑桥大学教授。 1953 年他们创立了 DNA 的双螺旋结构模型,获得 1958 年诺贝尔奖。

1956 年 Joe Hin Tjio 和 Albert Levan Hereditas 确定人类共有 23 对染色体。 Arthur Kornberg 分离出 DNA 聚合酶。

1957 年 Francis Crick 发表《论蛋白质合成》的演讲,提出 DNA 制造蛋白质的概念。 1959 年 Jerome Lejeune 发现唐氏综合症(先

天愚型)是由于人体的第 21 对染色体变异造成的。唐氏综合征是人类最早发现的因染色体缺陷造成的疾病。

1960 年 Sydney Brenner, Francis Crick , Francois Jacob 和 Jaque Monod 发现信使 RNA(mRNA) 。

1961 年 Francois Jacob 和 Jacques Monod 提出在分子水平上特定基因被激活或抑制的机制。 J.Monod ; F.Jacob ,法国科学家。由于他们提出了乳糖操纵子学说和在酶合成的遗传调控方面的重大贡献获得 1966 年诺贝尔奖。

1966 年 Marshall Nirenberg , Har Gobind Khorana 和 Robert Holley 阐明遗传密码。 D.Baltimore ; H.Temin ,美国科学家。由于他们各自发现了逆转录酶,打破了中心法则,该酶能使 mRNA 反转录成 cDNA ,使真核基

因的克隆表达成为可能,为病毒学、遗传学、基因工程作出了重大贡献,他们获得 1965 年诺贝尔奖。

1967 年 Mary Wei 和 Howard Green 使用体细胞杂合技术推进人类基因图谱绘制。 1969 年 Jonathan Beckwith 分离出一个细菌基因。

1970 年 Hamilton O.Smith 发现了限制性内切酶,对核苷酸的排列顺序的研究及 DNA 重组技术的研究提供了帮助。

D.Nathans ,美国霍普金斯大学医学院教授。由于他在限制性核酸内切酶方面的开创性成就获得 1978 年诺贝尔奖。

W.Arber ,瑞士巴塞尔生物研究中心教授。 1968 年他第一个指出了限制性核酸内切酶的存在并分离了 I 型酶 EcoB ,获得了 1978 年 获诺贝尔奖。

H Smith ,美国霍普金斯大学教授。 1970 年他首次分离纯化了Ⅱ型限制性核酸内切酶 Hind Ⅱ,并阐明了其切点的专一性,为基因工

程的诞生奠定了基础,获得 1978 年诺贝尔奖。 1972 年 Paul Berg 创造出第一个重组 DNA 分子。

1973 年 Herbert Boyer 和 Stanley Cohen 发展了重组 DNA 技术,发现改造后的 DNA 分子可在外来细胞中复制。

S.Cohen ,美国斯坦福大学分子生物学教授。他在质粒的研究中作出了开创性的研究, 1973 年他又第一个实现了细菌间抗药性基因的转移,创立了基因工程重组模式。科学界把这一年定为基因工程诞生之年,以纪念这位基 因工程的创始人。

1974 年美国发表 Belmont 报告,确立科研中进行人体实验的政策。

1975 年 MaryClaire King 和和 Allan C.Wilson 发现,人类和猩猩的基因相似度达到 99% 。 1975 年 Georges Kohler 和 Cesar Milstein 开发出生产单克隆抗体的技术。

1977 年 Walter Gilbert , Allan M.Maxam 和 Frederick Sanger 开发出 DNA 测序技术。 F.Sanger ,英国剑桥大学教授。由于他在蛋白质一级结构和核酸序列分析方面的天才创造和震惊世界的成果,在 1958 年和 1980 年先

后两次获得诺贝尔奖。他是生物医学科学领域里唯一两次获得这一最高荣誉的人,是一位谦虚谨慎、沉默寡言的伟大科学家。

1978 年 David Botstein 开创核酸限制性片段长度多态性分析技术,用于标志不同个体间的基因差别。

1978 年美国开始借助基因技术用大肠杆菌批量生产人类胰岛素。

P.Berg ,美国斯坦福大学化学教授。他首次用 SV40 作载体与λ噬菌体实现了两种病毒 DNA 的重组。由于他在重组 DNA 技术方面的功 绩获得 1980 年诺贝尔奖。

H.Boyer ,美国加州大学生化教授,美国基因工程公司董事长。 1977 年,他首次用细菌合成生长激素释放抑制素,是基因工程第一块

金牌的获得者。接着, 1980 年,他又与华盛顿大学的学者合作,用酵母生产了人干扰素。他筹建了美国基因工程公司,是基因工程研 究中的权威科学家。

1982 年 GeneBank 数据库建立。

W.Gilbert ,美国哈佛大学教授。他与瑞士苏黎世大学和生物基因 公司 教授 Weimann 合作,用细菌生产了人干扰素。 W.Gilbert 也是测定 DNA 序列的化学直读法创始人。由于他对科学的巨大贡献,获 1980 年诺贝尔奖。 1983 年 Kary Mullis 发展聚合酶链式反应( PCR )技术

1983 年辩认出与亨廷顿氏症有关的基因,这是科学家发现的第一个人类疾病基因。

1984 年 Alec Jeffreys 发明了基因指纹技术,可以用人的头发、血液和精液等来鉴定身份。 1984 年关于人类基因组测序的第一次公开讨论开始。 1986 年 Leroy Hood 开发自动测序机。 1988 年人类基因组组织 (HUGO) 成立。

1990 年美国正式启动人类基因组计划。随后,德国、日本、英国、法国和中国也相继加入该计划 。 1991 年 Craig Venter 开发出新的测序技术。 1994 年美国一公司推出新的转基因西红柿罐头,其保质期比普通西红柿更长,成为人类历史上第一个转基因食品。

1995 年 7 月,美国人类基因组研究所绘出了流感嗜血杆菌的基因图谱; 3 个月后,科学家又绘制出了生殖器支原体的基因图谱。 1996 酵母基因组测序完成。

1997 年苏格兰罗斯林研究所培育出世界上第一例体细胞克隆动物绵羊“多莉”。 1997 年大肠杆菌基因组测序完成。

1997 年参加人类基因组计划的科学家决定将研究成果无偿向全世界公开。 1998 年结核性分枝杆菌以及梅毒螺旋体基因组测序完成。 线虫基因组测序完成。

日本科学家用一头成年牛的体细胞克隆出 8 头克隆牛犊。

1999 年人类第 22 号染色体测序完成,这是第一个完成测序的人类染色体。 2000 年果蝇和拟南芥的基因组测序完成。

Craig Venter 和 Celera 公司和人类基因组计划相继宣布,人类基因组草图完成。 2001 年 Craig Venter 公布了绘制人类蛋白质组图谱的计划。 2002 年水稻、小鼠、疟原虫和按蚊基因组测序完成

2003 年人类基因组计划宣布,人类基因组序列图绘制成功,人类基因组计划的所有目标全部实现。 3.DNA 的发现

首先, 40 年代发现了生物的遗传物质是 DNA 。 Avery 在美国 1934 年的一次学术会议上,首次报导了肺炎球菌 (Djprococcus pneumonas) 的转化。超越时代的科学成就往往不容易很快被人们接受, Avery 成就的命运也是一样,当时并没有引起阵阵掌声。事隔

10 年,他的论文才公开发表; Avery 的工作意义深远,他不仅证明 DNA 是遗传物质、还证明 DNA 可以把一个细菌的性状转给另一个

细菌,理论意义十分重大。正如诺贝尔奖金获得者 Lederberg 指出的, Avery 的工作是现代生物学科学性的革命开端、也可以说是基 因工程的先导。

早在 1928 年, Griffith 等人就发现,肺炎链球菌使小鼠死亡的原因是引起肺炎。细菌的毒力(致病力)是由细胞表面夹膜中的多糖

所决定的。具有光滑外表的 S 型肺炎链球菌因为带有夹膜多糖而能使小鼠发病,具有粗糙外表的 R 型细菌因为没有夹膜多糖而失去致 病力。

Avery 用实验方法证实了 Griffith 的发现。 Avery 第一个用实验方法证明了基因就是 DNA 分子。其次, 50 年代搞清了生物遗传物

质的分子机制。 1953 年, Watson 利 Crick 提出了 DNA 结构的双螺旋模型。这一成就对于生命科学的发展,作出了可与达尔文学说 媲美、与孟德尔定律齐名的贡献。

1952 年 Alfred Hershey 和 Martha Chase 利用病毒证实,传递遗传信息的是 DNA 而不是蛋白质。

美国冷泉港卡内基遗传学实验室的科学家 Hershey 和他的学生 Chase 在 1952 年从事噬菌体侵染细菌的实验。噬菌体专门寄生在细菌 体内。噬菌体感染细菌时, 1 )先是其尾部吸附在细菌表面;

2 )随后像注射器那样由尾部将头部的 DNA 注入细菌体内,蛋白质外壳并不侵入; 3 )进入菌的 DNA 借助宿主细菌的原料和能量,合成噬菌体自身的 DNA 和蛋白质; 4 )新合成的 DNA 和蛋白质外壳,能组装成许许多多与亲代完全相同的子代噬菌体; 5 )细菌细胞因噬菌体的大量增殖而破裂,结果释放出几十甚至几百个既有蛋白质外壳又有头部 DNA 的完整结构的噬菌体。

第三, 60 年代确定了遗传信息的传递方式。从 1961 年开始,以 Nirenberg 等为代表的一批科学家,经过不倦的努力,确定遗传信息

是以密码方式传递的,每三个核苷酸组成一个密码子,代表一种氨基酸。

到 1966 年全部破译了 64 个密码,编排了一个震惊世界的密码字典,阐述了中心法则,提出的遗传信息流是 DNA → RNA →蛋白质。

从此,千百年来使人迷惑不解的种瓜得瓜、种豆得豆的遗传现象,在分子水平上得到了合理解释。

4.分子生物学的研究内容: 1 ) DNA 重组技术 2 )基因表达调控研究 3 )生物大分子的结构功能研究

4 )基因组、功能基因组与生物信息学研究

4.1 DNA 重组技术 DNA 重组技术(又称基因工程),它是将不同的 DNA 片段(某个基因或基因的一部分)按照人们的设计定向连接起

来,在特定的受体细胞中与载体同时复制并得到表达,产生影响受体细胞的新的遗传性状。 严格地说, DNA 重组技术并不完全等于基因工程,因为后者还包括其他可能使生物细胞基因组结构得到改进的体系。

DNA 重组技术有着广阔的应用前景

1 )可用于大量生产某些正常细胞代谢中产量很低的多肽,如激素、抗生素、酶类及抗体等,提高产量,降低成本,使许多有价值的多 肽类物质得到广泛应用。

2 )可用于定向改造某些生物的基因结构,使它们所具备的特殊经济价值得到成百上千倍地提高。如用在分解石油、生产避孕疫苗及在 实验室生产蜘蛛丝等。

3 )可用于基础研究。如对启动子的研究、增强子及对转录因子的克隆与分析的研究等。 4.2 基因表达调控研究

蛋白质分子参与被控制了细胞的一切代谢活动,而决定蛋白质结构和合成时序的信息都由核酸(主要是 DNA )分子编码,表现为特定的

核苷酸序列,所以基因表达实质上就是遗传信息的转录和翻译。

在个体生长发育过程中生物遗传信息的表达按一定的时序发生变化(时序调节),并随着内外环境的变化而不断加以修正(环境控制)

基因表达的调控主要发生在转录水平和翻译水平上。 原核生物的基因组和染色体结构比真核生物简单,转录和翻译在同一时间和空间内发生,基因表达的调控主要发生在转录水平上。

真核生物有细胞核结构,转录和翻译在时间和空间上是分开进行的,并且在转录和翻译后都有复杂的信息加工过程,其基因表达的调控 可以发生在各种不同的水平上。

基因表达调控主要表现在信号转导研究、转录因子研究及 RNA 剪接 3 个方面。

信号传导是指外部信号通过细胞膜上的受体蛋白传到细胞内部,并激活诸如离子通透性、细胞形状或其它细胞功能方面的应答过程。

当信号分子(配体)与相应的受体作用后,可以引发受体分子的构型变化,使之形成专一性的离子通道,也可以引发受体分子的蛋白激

酶或磷酸酯酶活性,还可以通过受体分子指导合成 cGMP、cAMP、肌醇三磷酸等第二信使分子。 信号传导引起细胞功能的改变,主要是由于信号最后活化了某些蛋白质分子,使之发生构型变化,从而直接作用于靶位点,打开或关闭 某些基因。

转录因子是一群能与基因 5 \\'端上游特定序列专一结合,从而保证目的基因以特定的强度在特定的时间与空间表达的蛋白质分子。

在对植物的某些性状进行遗传分析时发现,某些基因的突变会影响其它基因的表达。 例如,有 20 多个基因参与玉米花青素的生物合成,但其中的 Cl、r、pl、或 b 基因发生突变后,则这个代谢途径中的结构酶基 因全部被关闭。

真核基因在结构上的不连续性是近 10 年来生物学上的重大发现之一。当基因转录成 premRNA 后,在 5 \\'端加帽, 3 \\'端加 poly (

A ),还要切去内含子,使外显子(编码区)相连后成为成熟 mRNA 。

研究发现,许多基因中的内含子并不是一次全部切去,而是在不同的细胞或不同的发育阶段选择性剪切其中部分内含子,生成不同的 mRNA 及蛋白质分子。

RNA 选择性剪切是真核基因表达调控中一种比较灵活的方式。 4.3 生物大分子的结构功能研究——结构分子生物学

一个生物大分子,包括核酸、蛋白质、多糖,具有生物活性的条件有两个: 1 )具有特定的空间结构(三维结构);

2 )在它发挥生物学功能的过程中必定存在着结构和构象的变化。

结构分子生物学就是研究生物大分子特定的空间结构及结构的运动变化与其生物学功能关系的科学。

它包括结构的测定、结构运动变化规律的探索及结构与功能间的相互关系 3 个主要研究方向。 4.4 基因组、功能基因组与生物信息学

2001 年 2 月, Nature 和 Science 同时发表了人类基因组全序列,是人类历史上最伟大的成就之一。

现已有数十种原核生物、酵母、果蝇、拟南芥等真核生物的基因组基本被破译了,为人类认识自然、改造自然打下了坚实的基础。

测定基因组序列是了解基因的第一步,只有知道了基因所编码的蛋白质的功能和活性,才能指导人们利用这些基因产物。

于是,又提出了“蛋白组”计划(又称“后基因组计划”或“功能基因组计划”) , 目的是快速、高效、大规模鉴定基因的产物和功

能。基因组信息量庞大,如人细胞中携带 29 亿多个碱基对。

依靠计算机快速高效运算并进行统计分类和结构功能预测的生物信息学相应诞生了。 有了生物信息学知识,人们可以最大限度地开发和运用基因组学所产生的庞大数据。 5.分子生物学展望

1 )绵羊多利是核转移克隆技术的第一次大的成功。在这一技术中,一个细胞的 DNA 被转移到失去自身遗传物质的空的卵细胞中。然

后,卵细胞在转移 DNA 的控制下进行发育。成为克隆技术发展的一个里程碑。

2 ) Kind 的研究组在牛和猪的细胞中成功地使用了基因打靶技术的技术,并称他们计划培育“敲除”猪 这种猪将携带的一种

蛋白质来帮助人体免疫系统接受移植的猪器官。 3 )人类基因组计划与生物制药产业发展前景。

———人类基因组计划( HGP )是人类科学史上的伟大工程,人类基因组序列的“工作框架图”的绘就,是该计划实施进程中的一个重

要里程碑;——— HGP 从整体上解决肿瘤等疾病的分子遗传学问题, 6 千多种单基因遗传病和多种多基因疾病的致病基因和相关基因

的定位、克隆和功能鉴定是 HGP 的核心部分,它将彻底改变传统新药开发的模式,并赋予基因技术的商业价值;

——— HGP 将进一步深化生物制药的产业结构,引发基因诊断、基因疫苗、基因治疗、基因芯片等新兴产业;

——— HGP 完成后,人类基因序列将全部输入公共基因数据库,使我国的制药工业在一个新的起点上与国外制药企业展开竞争,从我国自主克隆的人类基因和公共数据库的人类基因中开发出具有自主知识产权的基因组药物,成为我国生物制药摆脱困境的有效途径;

———国内上市公司已进军基因技术的相关产业,但尚处于初级阶段, HGP 是国内生物制药公司进行企业模式调整的重要契机,未来生

物制药公司的竞争力主要取决于推出自主知识产权新药的速度、数量和质量。

4 )人类基因组学的前途有关基因组的大量知识将扩大我们对生物学过程的认识,并带来可评价患病危险性的新诊断手段,创立个人化

医疗学。基因组信息的利用会增进对生物学过程的了解而变革生命科学,使科学家可以针对着影响健康和疾病的具体过程。

获得利益的商业领域有药物发现和开发、医学诊断、农业,等等。

影响新药开发的一个最重要的因素是可以用于开发新药的已知目标分子数量有限。疾病目标分子可以受一种药物影响并在人体内引起后

续的所希望的生物学反应。历史上,发现新目标分子的过程极慢,极费钱,因为它依赖于做出发现的试验和纠正方法。基因组学研究将

使药物设计人员直接针对有利害关系的分子,所以减少上述依赖。这样不仅是生产出新的更好的药物,而且缩短新药上市周期,并降低 成本。

由于药物的严重副作用,美国每年有 220 万人入院,因这些副作用而死亡者超过 10 万人。已有具体器官对药物的基因表达分布图,研

究人员可以更精确地研究新药化合物的毒性。此外,基因表达数据与代谢途径多态性信息结合起来,将为个别患者对不同剂量的反应方

式提供重要指标,因而明显减少治疗中产生的意外副作用。

受人类基因组数据影响的另一领域是制药基因组学。这个学科的重点是找出患者内可能影响药疗功效即个人对一具体药物的吸收与代谢

的遗传变异,发展更加个人化的药物疗法。因为越来越多的证据说明,某一药物并非对所有的人有同样的作用,所以制药基因组学对于

制药和生物技术界来说已变得非常重要,以致几乎所有制药公司都在成立制药基因组学机构。 以基因组学为基础的新治疗学将集中确定

某个人患某一种病的危险性,而留意该患者的具体基因以及与疾病相关的任何变化。这些新诊断手段可能对一患者患一具体病症的潜在

危险性做出更准确评价,给予更好的预防性治疗。

农业是可能得益于基因组学研究的另一领域。对动植物疾病进行诊断并针对那些疾病发展处治方法的能力,应能使农产品品质改善,产

量提高。例如,来自疾病的遗传信息的比较或抗虫害植物品系和不抗虫品质的对比以及选育计划中有利试验的运用,将使可在世界各个

不同农业区种植的新品系数量和成功率明显增加。这样不仅会增加食物数量,也提高其营养质量。 5 )基因疗法的典型例子是半乳糖血症病人的基因治疗。这种病人由于细胞内缺少基因 G ,不能产生半乳糖 1 磷酸干扰素基因,每 106 个细胞能生产干扰素 5x106 单位, 并且 95 %分泌至细胞外。

1985 年,美国加州大学 Maeda 用杆状病毒作载体,家蚕作表达系统,合成α干扰素基因在家蚕细胞及家蚕中的高表达”研究。他们用 PCR 技术从人染色体中扩增出了 566bp α 1 干扰素基因,用

家蚕核型多角体病毒 (BmNPV) 转移载体 pBF5 介导,在多角体基因强启动子驱动下,分别在家蚕细胞和虫体中实现了高效表达。采用微

载体 Cytodex3 高密度培养家蚕细胞 ( 10L 规模 ) ,α 1 干扰素效价达到 6.4x106 单位/ m1 ;当用重组病毒注射感染 5 龄家蚕

时 (3 万条虫规模 ) ,表达效价平均达到 1x107 单位/条蚕。

α模板 dNMP 高能复合物。 DNA 聚

合酶具有对此复合物核对的能力,看掺入的核苷酸是否正确。这个核苷酸( dNMP )这时可能被释放的机会远远高于正确核苷酸。这 就是动力学校对模型。

4 ) DNA 聚合酶具有聚合酶活性,还具有 5 \\' → 3 \\' 和 3 \\' → 5 \\' 的外切酶活性。 DNA 聚合酶的 3 \\' → 5 \\' 外切酶活性可以

随时将已经掺入的错配的脱氧核糖核苷酸从生长的多核苷酸链上去除,保证了 DNA 复制的忠实性和准确性。

1.DNA 的半保留复制机理

DNA 的复制是分别以亲代 DNA 链为模板合成两条子代 DNA 链;在子代 DNA 双链中,一条是新合成的,一条是亲代的,称为 DNA 的半保留复制。

2.3.2 复制的起点、方向和速度

复制时,双链 DNA 要解开两股链分别进行,所以这个复制起点呈现叉子的形式 , 称为复制叉。 复制子( replicon )定义: DNA 分子上一个独立的复制单位。一个复制子只含有一个复制起点( origin,ori )。

通常,细菌、病毒和线粒体的 DNA 分子都是作为单个复制子完成复制的,而真核生物基因组可以同时在多个复制起点上进行双向复制。

复制叉以 DNA 分子上某一特定顺序为起点,向两个方向等速生长前进。一个复制原点连接到任一 DNA 分子上都支持其复制的能力。复

制原点一般由 AT 丰富区组成。在真核细胞中, DNA 的复制属于细胞周期的一部分。细菌中, DNA 复制与细胞生长相协调。首先是

复制周期的起始频率被调整到与细胞生长

的速率相适应,其次是复制周期的完成与细胞分裂相联系。 2.3.3 复制的几种主要方式 2.3.3.1 线性 DNA 双链的复制线性 DNA 先

在 ori 处形成复制眼,从复制眼开始可以单向或双向复制,真核生物都是多复制眼起始的双向复制。 2.3.3.2 环状 DNA 双链的复制 1 )θ型复制

环形 DNA 大多采用θ型复制,如 E.coli 。

特点:从原点 ori 开始,通常采用双向等速复制,不断扩大复制泡,形成θ环。 2 )滚环型复制( rollingcircle )

某些环形的病毒 DNA ,如θ x174、λ噬菌体都是以这种方式复制。 这是一种单向复制类型。

3 ) D 环复制双链环在固定点解开进行复制。但两条链的合成是高度不对称的,一条链上迅速合成出互补链,另一条链则成为游离的 单链环( D 环)。

2.4 原核生物和真核生物 DNA 的复制特点 2.4.1 原核生物 DNA 的复制特点 2.4.1 .1DNA 双螺旋的解旋

DNA 复制时,双链首先解开,形成复制叉

复制叉的形成过程有多种酶和蛋白质参与。将主要的酶和蛋白质介绍如下。 1 )单链结合蛋白( SSB 蛋白) SSB 蛋白可牢固地结合在单链 DNA 上,在原核生物中表现出协同效应,如第一个 SSB 蛋白结合到

DNA 上去的能力为 1 ,第二个 SSB 蛋白结合能力则高达 103 。 SSB 蛋白的作用是保证被解链酶解开的单链在复制完成前能保持单

链结构,它以四聚体形式存在于复制叉处,待单链复制后才掉下,重新循环。所以, SSB 蛋白只保持单链的存在,并不起解链的作用。

SSB 没有催化功能,它可以特异性地结合在单链区,使之免被核酸酶水解,起到保护和维持单链的作用。 2 ) DNA 解链酶( DNAhelicase )

用于把 DNA 双链解开形成单链。具有 ATPase 活性,利用水解 ATP 释放的能量,催化双链 DNA 解链。大部分 DNA 解链酶(包括大肠

杆菌解链酶 II、III、T4 噬菌体 dda 基因、T4 基因 41 和人解链酶等)可沿滞后链模板的 5 \\'→ 3 \\'方向并随着复制叉的前进

而移动,只有另一种解链( Rep 蛋白)是沿前导链模板的 3 \\'→ 5 \\'方向移动。因此推测 Rep 蛋白和特定 DNA 解链酶分别在 DNA 的

两条母链上协同作用,以解开双链 DNA 。

DNA 的解链过程,首先是在拓扑异构酶 I 的作用下解开负超螺旋,并与解链酶共同作用,在复制起点处解开双链。

参与解链的除一组解链酶外,还有 DNA 蛋白等。

一旦局部解开双链,就必须有 SSB 蛋白来稳定解开的单链,以保证局部结构不会恢复成双链。接着,由引发酶组成的引发体迅速作用

于两条单链 DNA 上。不论是前导链还是滞后链,都需要一段 RNA 引物以开始子链 DNA 的合成 2.4.1 .2 冈崎片段与半不连续复制在

DNA 的复制过程中,前导链是连续复制的,而滞后链是通过冈崎片段的连接来合成的,是不连续的,称之为 DNA 的半不连续复制。所有

DNA 聚合酶的方向都是 5 \\'→ 3 \\',而不是 3 \\'→ 5 \\'。为了解释 3 \\'→ 5 \\'是如何合成滞后链的,冈崎提出了 DNA 的半不连续复制。

现在已知,一般原核生物的冈崎片段要长些,真核生物中的要短些。这种前导链的连续复制和滞后链的不连续复制在生物界是有普遍性

的,因而称之为 DNA 的半不连续复制。 2.4.1 .3 复制的引发和终止

复制起始时发生的事件:①双链 DNA 在一个很小的区域内打开,这是 oriC 区域特有的;②由解旋酶催化,开始解螺旋,并持续进行

下去;③形成引物,第一个核苷酸装配到引物上;这些事件对前导链只发生一次,而后滞链上每次开始合成冈崎片段时都要发生。

目前已知的 DNA 聚合酶都只能延长已存在的 DNA 链,而不能从头合成 DNA 链。

研究发现, DNA 复制时,往往先由 RNA 聚合酶在 DNA 模板上合成一段 RNA 引物,再由 DNA 聚合酶从 RNA 引物 3 \\'端开始合成新的

DNA 链。对于前导链来说,这一引发过程比较简单,只要有一段 RNA 引物, DNA 聚合酶就能以此为起点一直合成下去。但对于滞后链

来说,引发过程就十分复杂,需要多种蛋白质和酶的协同作用,还牵涉到冈崎片段的形成和连接。 滞后链的引发过程:

引发体:后滞链的引发过程往往由引发体( primosome )来完成。先是由 6 种蛋白: n,n \\' ,n \\'\\' ,dnaB,C 和 I 构成引发前体,而

后与引发酶( primase )结合进一步组装成引发体。

引发体像火车头一样在滞后链分叉的方向上前进,并在模板上断断续续地引发生成滞后链的引物 RNA 短链,再由 DNA 聚合酶 III 作

用合成 DNA ,直到遇到下一个引物或冈崎片段为止。由 RNaseH 降解 RNA 引物,并由 DNA 聚合酶 I 将缺口补齐,再由 DNA 连接酶

将两个冈崎片段连在一起形成大分子 DNA 。

前导链的连续合成和后滞链的不连续合成

a.旋转酶( topoII )改变双螺旋的构象,解螺旋酶解开双链。 b.SSB 结合到解开的单链上。 c.引发体合成 RNA 引物。 d.DNA 聚合酶Ⅲ作用下合成先导链。 e.滞后链开始合成,形成第一个冈崎片段。 f.复制叉继续前进,前导链连续合成,滞后链上合成新

的 RNA 引物。 g.第二个冈崎片段形成, DNA 聚合酶Ⅰ切去引物,并加上脱氧核苷三磷酸。 h.间隙被 DNA 连接酶封闭。 链的终止

除 Tus 蛋白以外,链的终止看起来不需要太多的蛋白质参与。当复制叉前移,遇到 20bp 重复性终止子序列( Ter )时, TerTus 复合物能阻挡复制叉的继续前移,等到相反方向的复制叉到达后在 DNA 拓扑异构酶 IV 的作用下使复制叉解体,释放子链(图 223 )。 2.4.1 .4DNA 聚合酶

现已发现在大肠杆菌中存在 DNA 聚合酶 I、II、III 。

1)DNA 聚合酶Ⅰ主要负责 DNA 损伤的修复和冈崎片段之间间隙的填补。用枯草杆菌蛋白酶处理 DNA 聚合酶Ⅰ可得两个片段,大片段

分子量 76kd ,被叫作 klenow 片段,广泛用于 DNA 序列分析中。

① 5\\' → 3\\' 聚合活性要求有双链 DNA 模板和具有 3\\' 羟基的引物,活性很高,可达 1000 核苷酸 /min 。② 3\\' → 5\\' 外切活性可

以对不配对的局部单链进行识别,切除不配对碱基,又称“校正功能”。③ 5\\' → 3\\' 外切活性主要功能是切除复制过程中的引物。

pol Ⅰ的 5\\' → 3\\' 外切活性有三个特点: a.必须有 5\\'P 末端。 b.被切除的核苷酸必须是氢键配对的。 c.可以切除脱氧核糖

核苷酸,也可以切除核糖核苷酸。此酶被认为在切除由紫外线照射而形成的嘧啶二聚体中起着重要作用。它也可用以除去冈崎片段 5 \\'端 RNA 引物,使冈崎片段间缺口消失,保证连接酶将此片段连接起来。 DNA 聚合酶 II 是一条 120kD 的肽链,催化 5 \\'→ 3 \\'方

向合成 DNA ,也具有 3 \\'→ 5 \\'外切酶活性但没有 5 \\'→ 3 \\'外切酶活性。可能在当细胞 DNA 受到化学或物理损伤时,

DNA 聚合酶 II 在修复过程中起特殊作用。 DNA 聚合酶Ⅲ pol Ⅲ是体内 DNA 复制的主要承担者,是复制的主要酶类。全酶由多亚基

组成,至少有 10 种,共 22 个亚基:α 2 ε 2 θ 2 δ 2 γ 2 η 2 δ \\'2 χ 2 θ 2 β 2 其中α、ε、θ三种亚基组成核心酶, 其它为辅助蛋白。

rRNA 的功能与蛋白质生物合成相关,可分别与 mRNA、tRNA 作用,催化肽键的形成。引物酶和 RNA 聚合酶引物酶:用于合成引物 的酶。利福平:抑制 RNA 的转录,使细菌无法繁殖。用利福平处理发现:先导链不能合成,而后随链能合成。

解螺旋酶用于把 DNA 双链解开形成单链。具有 ATPase 活性,利用水解 ATP 释放的能量,催化双链 DNA 解链。

2.4.2 真核生物 DNA 的复制特点

真核生物 DNA 的复制与原核生物 DNA 的复制有很多不同。真核生物每条染色体上可以有多处复制起点,而原核生物只有一个起始点。

真核生物的染色体在全部完成复制之前,各个起点上 DNA 的复制不能再开始,而在快速生长的原核生物中,复制起点上可以连续开始

新的 DNA 复制,表现为虽只有一个复制单元,但可有多个复制叉。真核生物 DNA 的复制子称为 ARS ( autonomouslyreplicatingsequences ),长约 150bp 左右,包括数个复制起始必需的保守区。真核生物 DNA 复制的起始需

要起始原点识别复合物( ORC )参与。真核生物 DNA 复制叉的移动速度大约只有 50bp/s ,还不到大肠杆菌的 1/20 ,因此,人类

DNA 中每隔 3000 ~ 300000bp 就有一个复制起始位点。真核生物 DNA 复制必需的成份 1.染色体 DNA 复制必需三种核苷酸序列①复制起点②着丝粒③端粒。 2.RNA 引物 (RNAPrimer) ,一般 8 ~ 14nt ,带游离 3\\'OH 末端。

3.参加 DNA 复制的主要酶和蛋白质。① DNA 聚合酶 (DNAPolymerase) 真核 DNA 复制的主要酶 DNAPola/ δ。功能 : 从 5\\' → 3\\'

方向延伸与模板互补的子代链。②引发酶 (Primase) 与其他多种蛋白组成多蛋白复合体 引发体 (Primosome) ,催化 RNA 引物合成

和复制起始。③ DNA 连接酶 (DNALigase) ,催化一个双链 DNA 的 5 \\' 磷酸与另一双链 DNA 的 3 \\' OH 形成磷酸二酯键。④ DNA

解链酶 (DNAHelicase), 打开 DNA 双链。⑤增殖细胞核抗原 (Proliferatingcellnuclearantigen , PCNA) ,辅助催化前导链合成。

⑥端粒酶 (Telomerase) 末端复制问题。端粒酶负责染色体末端 ( 端粒 ) 复制 , 是由 RNA 和蛋白质组成的核糖核蛋白。其中的 RNA 成分是端粒复制的模板 ( 因此端粒是逆转录酶 ) 。作用 : 维持端粒长度。端粒酶活性可用基于 PCR 的“ TRAP ” ( Telomeraserepeatamplificationprotocol )法测定( Kim,Netal.,science,266,20112014(1994) 端粒与细胞寿命。端粒、端

粒酶与肿瘤的关系:绝大多数恶性肿瘤具有端粒酶活性但端粒缩短,但也有约 5% 的肿瘤无端粒酶活性且端粒较长。

端粒酶作为新的肿瘤标志和肿瘤治疗靶点。

真核生物中发现有 5 种 DNA 聚合酶,分别是:α、β、γ、δ、ε。

⑴ DNA 聚合酶α是 DNA 复制的主要酶类,由 4 个亚基组成。原因是:①所有强烈抑制α酶的抑制剂都能抑制细胞的复制。②α酶的

温度敏感突变株使该细胞的 DNA 复制成呈温度敏感型。③显微注射α酶的抗体可以抑制 DNA 的复制。④α酶的活性随细胞周期而变化

, S 期活性最高。⑵ DNA 聚合酶δ具有 3 \\'→ 5 \\'外切酶活性,对于复制的真实性十分重要。同是也是前导链合成的主要酶类。聚合 酶γ负责线粒体基因组的复制。

目前认为:α酶和δ酶都是真核 DNA 复制酶。δ酶在复制中合成前导链,α酶合成后滞链。δ和ε都具有 3 ‘→ 5 \\'外切核酸酶的

活性,说明二者都有校对功能。δ和ε之间的差别是:在催化持续的 DNA 合成时,δ需要一个辅助蛋白因子--增值细胞核抗原

( proliferatingcellnuclearantigen,PCNA ) , 而ε则不需要。β可能主要在 DNA 损伤的修复中起作用。ε的主要功能可能是在 去掉 RNA 引物后把缺口补全。 2.4.3 DNA 复制的调控

原核细胞的生长和增殖速度取决于培养条件,但在生长、增殖速度不同的细胞中, DNA 链延伸的速度几乎是恒定的,只是复制叉的数 量不同。

迅速分裂的细胞具有较多复制叉,而分离缓慢的细胞复制叉较少并出现复制的间隙。细胞内复制叉的多少决定了复制起始频率的高低,

这可能是原核细胞复制的调控机制。复制起始频率的直接调控因子是蛋白质和 RNA 。 2.4.3 .1 大肠杆菌染色体 DNA 的复制调控 原核生物 DNA 链的延伸速度是恒定的。与生长、增殖相配合协调的 DNA 的合成,主要依靠复制叉数量的不同。迅速分裂的细胞具有

较多的复制叉,分裂缓慢的细胞复制较细胞复制叉的多少取决于复制起始的频率,这是原核细胞复制的调控点。复制子的调控由复制

起始因子和起始位点两部分组成。 E.coli 的起始位点主要是 oriC ,与蛋白相互作用来启动复制。主要的起始因子有 dnaA、dnaH 等蛋白质,它们通过与始位点形成复合物相互作用,确定复制的起始频率。研究发现: dnaA 对复制起正调控作用。

2.4.3 .2ColE1 质粒 DNA 的复制

ColE1DNA 复制不依赖于其本身编码的蛋白质,而完全依靠宿主 DNA 聚合酶。质粒 DNA 编码两个负调控因子 Rop 蛋白和反义 RNA ( RNA1 ),它们控制了起始 DNA 复制所必须的引物合成 .细胞内 RNA1 的浓度决定了 ColE1 质粒的复制起始频率。 Rop 蛋白能

提高 RNA1 与引物前体的相互作用,从而加强了 RNA1 的负调控作用。(图 224 )

2.4.3 .3 真核细胞 DNA 复制的调控真核细胞中 DNA 复制有三个调控点:①细胞生活周期水平的调控 也称为限制点调控,即决定细胞停留在 G1 还是进入 S 期。许多外部因素和细胞因子参与限制点调控。促细胞分裂剂、致癌剂、外科

切除、细胞质因子等可诱发 G1 进入 S 期。 ②染色体水平的调控

决定不同染色体或同一染色体不同部位的复制子按一定顺序在 S 期起始复制,这种有序复制的机理还不清楚。

③复制子水平的调控。

决定复制的起始与否。这种调控从单细胞生物到高等生物是高度保守的。

此外,真核生物复制的起始还包括转录活化、复制起始复合物的合成和引物合成等阶段,许多参与复制起始蛋白的功能与原核生物中类

似。 2.5DNA 的修复 DNA 修复 (DNArepairing) 是细胞对 DNA 受损伤后的一种反应,这种反应可能使 DNA 结构恢复原样,重新能执 行它原来的功能。 2.5.1 回复修复

这是较简单的修复方式,一般都能将 DNA 修复到原样。

1.光修复 这是最早发现的 DNA 修复方式。修复是由细菌中的 DNA 光复活酶来完成,此酶能特异性识别紫外线造成的核酸链上相

邻嘧啶共价结合的二聚体,并与其结合,这步反应不需要光;结合后如受 300 - 600nm 波长的光照射,则此酶就被激活,将二聚体

分解为两个正常的嘧啶单体,然后酶从 DNA 链上释放, DNA 恢复正常结构。后来发现类似的修复酶广泛存在于动植物中,人体细胞 中也有发现。

2.单链断裂的重接 DNA 单链断裂是常见的损伤,其中一部分可仅由 DNA 连接酶 (ligase) 参与而完全修复。此酶在各类生物各种

细胞中都普遍存在,修复反应容易进行。但双链断裂几乎不能修复。

3.碱基的直接插入 DNA 链上嘌呤的脱落造成无嘌呤位点,能被 DNA 嘌呤插入酶 (insertase) 识别结合,在 K +存在的条件下,

催化游离嘌呤或脱氧嘌呤核苷插入生成糖苷键,且催化插入的碱基有高度专一性、与另一条链上的碱基严格配对,使 DNA 完全恢复。

2.5.2 切除修复 (excisionrepair) 是修复 DNA 损伤最为普遍的方式,对多种 DNA 损伤包括碱基脱落形成的无碱基位点、嘧啶二聚

体、碱基烷基化、单链断裂等都能起修复作用。这种修复方式普遍存在于各种生物细胞中,也是人体细胞主要的 DNA 修复机制。修

复过程需要多种酶的一系列作用,基本步骤包括:

①首先由核酸内切酶识别 DNA 的损伤位点,在损伤部位的 5 ′侧切开磷酸二酯键。不同的 DNA 损伤需要不同的特殊核酸内切酶来识

别和切割。②由 DNA 解链酶将有损伤的 DNA 片段解离。③在 DNA 聚合酶的催化下,以完整的互补链为模板,按 5 ′→ 3 ′方向合

成 DNA 链,填补已切除的空隙。④由 DNA 连接酶将新合成的 DNA 片段与原来的 DNA 断链连接起来。这样完成的修复能使 DNA 恢复

原来的结构。 2.5.3 重组修复 (recombinationalrepair) 主要用于 DNA 复制时的损伤修复。 DNA 重组修复方式: ①受损伤的 DNA 链复制时,产生的子代 DNA 在损伤的对应部位出现缺口。

②另一条母链 DNA 与有缺口的子链 DNA 进行重组交换,将母链 DNA 上相应的片段填补子链缺口处,而母链 DNA 出现缺口。

③以另一条子链 DNA 为模板,经 DNA 聚合酶催化合成一新 DNA 片段填补母链 DNA 的缺口,最后由 DNA 连接酶连接,完成修补。重

组修复不能完全去除损伤,损伤的 DNA 段落仍然保留在亲代 DNA 链上,只是重组修复后合成的 DNA 分子是不带有损伤的,但经多次

复制后,损伤就被“冲淡”了,在子代细胞中只有一个细胞是带有损伤 DNA 的。 2.5.4 SOS 修复

SOS 修复是指 DNA 受到严重损伤、细胞处于危急状态时所诱导的一种 DNA 修复方式,修复结果只是能维持基因组的完整性,提高细

胞的生成率,但留下的错误较多,故又称为错误倾向修复 (error  pronerepair) ,使细胞有较高的突变率。当 DNA 两条链的损

伤邻近时,损伤不能被切除修复或重组修复,这时在核酸内切酶、外切酶的作用下造成损伤处的 DNA 链空缺,再由损伤诱导产生的一

整套的特殊 DNA 聚合酶 SOS 修复酶类,催化空缺部位 DNA 的合成,这时补上去的核苷酸几乎是随机的,但仍然保持了 DNA 双链的

完整性,使细胞得以生存。但这种修复带给细胞很高的突变率。应该说目前对真核细胞的 DNA 修复的反应类型、参与修复的酶类和修

复机制了解还不多,但 DNA 损伤修复与突变、寿命、衰老、肿瘤发生、辐射效应、某些毒物的作用都有密切的关系。人类遗传性疾病

已发现 4000 多种,其中不少与 DNA 修复缺陷有关,这些 DNA 修复缺陷的细胞表现出对辐射和致癌剂的敏感性增加。 DNA 修复小结

环境和生物体内的因素都经常会使 DNA 的结构发生改变。 DNA 的复制会发生碱基的配对错误;体内 DNA 会有自发性结构变化,包括

DNA 链郑州看小孩癫痫病哪家医院好上的碱基异构互变、脱氨基、碱基修饰、DNA 链上的碱基脱落等。。外界射线的照射等物理因素,烷化剂、碱基类似物、修饰

剂等化学因素都能损伤 DNA 的结构,变化包括有相邻嘧啶共价二聚体的形成、碱基、脱氧核糖和磷酸基团的烷基化和其它修饰、碱 基脱落、DNA 单链断裂、双链断裂、DNA 链内交联、链间交联、DNA 与周围的蛋白质交连等。 最后能导致 DNA 的点突变、DNA 核苷酸的缺失、插入或转位、DNA 链的断裂等,结果可能影响生物细胞的功能和遗传特性,这些改

变可能会导致细胞死亡、也有机会使细胞获得新的功能或进化,也可能细胞只有 DNA 结构的遗传性改变而没有表型变化,视 DNA 结

构变化的部位、类型和范围不同而异。

生物在进化过程中获得的 DNA 修复功能,对生物的生存和维持遗传的稳定性是至关重要的。对有些 DNA 的损伤,细胞能将其完全修

复到原样,如可将嘧啶二聚体切开、DNA 单链断裂可重新连接、碱基缺失可再配对插入、加成的烷基可以移除、一条链上的碱基或核

苷酸的错误可以切除并依赖互补链作模板而复制重新修复等。对 DNA 较严重的损伤,细胞可采取重组修复、SOS 修复等方式进行反

应,以期提高细胞的存活率,但不能完全消除 DNA 的损伤,会带给细胞较高的突变率。 DNA 的损伤和修复与遗传、突变、寿命、衰

老、辐射效应、肿瘤发生、某些毒剂的作用、以及某些遗传性疾病等有密切的关系。目前对 DNA 损伤修复的认识还不透彻。 2.6 DNA 的转座

DNA 的转座,或称移位( transposition ),是由可移位因子( transposableelement )介导的遗传物质重排现象。与 DNA 的同源

重组相比,转座作用发生的频率虽然要低得多,但它仍然有着十分重要的生物学意义

1.转座子( transposon,Tn )是存在于染色体 DNA 上可自主复制和位移的基本单位。插入序列( insertionsequence , IS )它

们是不含宿主基因的最简单的转座子,它们是细菌染色体或质粒 DNA 的正常组成部分。转座子常常被定位到特定的基因中,造成该基 因的突变。

插入序列对插入点后的基因产生极性效应。 IS 序列都是可以独立存在的单元 , 带有介导自身移动的蛋白。 IS 除带有编码转座酶的 基因外,不带任何其它遗传信息。 IS 的结构特点:①长度在 1000bp 左右。②末端具有倒置重复序列,转座时常复制靶位点附近的一小段 DNA ( 4 ~ 15bp ),形

成位于 IS 两端的正向重复区。③具有编码转座酶的基因。

2 复合式转座子( compositetransposon )是由两个重复序列夹着一个或多个结构基因组成的转座单位,往往存在于 R 因子及其它

质粒中。有的复合转座子的重复序列就是 IS 。

IS 序列插入到某个功能基因两端时就可能产生复合式转座子。

除了末端带有 IS 序列的复合式转座子以外,还存在一些没有 IS 序列、体积庞大的转座子—— TnA 家族,一般长 4500~200000bp 。 3 转座机制

转座时发生的插入作用有一个普遍的特征,即受体分子中有一段很短的( 3 ~ 12bp )、被称为靶序列的 DNA 会被复制,使插入的

转座子位于两个重复的靶序列之间。 转座可分为复制性和非复制性两大类:

1 )在复制性转座中,整个转座子被复制了,所移动和转位的仅仅是原转座子的拷贝。转座酶( transposase )和解离酶

( resolvase )分别作用于原始转座子和复制转座子。 TnA 类转座主要是这种形式。 2 )在非复制性转座中,原始转座子作为

一个可移动的实体直接被转位, IS 序列、Mu 及 Tn5 等都以这种方式进行转座。 2.6.3 转座作用的遗传学效应 1 )转座引起插入突变

如果插入位于某操纵子的前半部分,就可能造成极性突变,导致该操纵子后半部分结构基因表达失活。 2 )转座产生新的基因 3 )转座产生染色体畸变 4 )转座引起生物的进化

重点、难点及对学生的要求(掌握、熟悉、了解、自学) 掌握 DNA 的组成及结构结构,了解核小体的装配,了解原核生物基因组的特点和真核生物基因组的结构特点。掌握 DNA 分子复

制的一般特点。掌握真核生物 DNA 复制必需的成份。掌握 DNA 复制的调控。 了解 DNA 的修复,掌握 DNA 的转座的机理。

辅助教学情况(多媒体课件、板书、绘图、标本、示教等) 复习思考题 1.核酸的组成 2.何为 C 值矛盾

3.真核细胞 DNA 序列大致上可分为哪 4 类

4.为什么说细胞对 DNA 损伤的修复能力对细胞的生存是至关重要的 ? 5.体内那些因素会导致 DNA 结构的变化 ? 细胞能采取那些办法保持 DNA 结构的稳定性 ? 6.那些环境因素容易损伤生物体内的 DNA? 损伤有那些方式和类型 ? 结果对生物细胞会有些什么影响 ? 7.现在所知生物细胞对 DNA 损伤修复有那些方式 ? 修复反应的结果会如何 ?8..真核生物基因组的结构特点

9.原核生物基因组的特点 10.描述 DNA 的二级结构

11.DNA 分子复制的一般特点是什么 12.DNA 的半保留复制机理 13.真核生物 DNA 的复制特点

14.为什么说细胞对 DNA 损伤的修复能力对细胞的生存是至关重要的 ? 15.体内那些因素会导致 DNA 结构的变化 ? 细胞能采取那些办法保持 DNA 结构的稳定性 ? 16.那些环境因素容易损伤生物体内的 DNA? 损伤有那些方式和类型 ? 结果对生物细胞会有些什么影响 ? 17.现在所知生物细胞对 DNA 损伤修复有那些方式 ? 修复反应的结果会如何 ? 第三章 生物信息的传递(上)-转录

本单元或章节的教学目的与要求:掌握转录的基本过程、机制 授课主要内容及学时分配 8 学时

DNA 序列是遗传信息的贮存者,它通过自主复制得到永存,并通过转录生成信使 RNA、翻译成蛋白质的过程来控制生命现象。基因表达

包括转录( transcription )和翻译( translation )两个阶段。转录是指以 DNA 的一条链为模板在 RNA 聚合酶催化下,按照碱基

配对原则,合成一条与 DNA 链的一定区段互补的 RNA 链的过程称为转录。翻译是指以新生的 mRNA 为模板,把核苷酸三联遗传密码子

翻译成氨基酸序列、合成多肽的过程,是基因表达的最终目的。

编码链(有义链):我们把与 mRNA 序列相同的那条 DNA 链称为编码链( coding strand )。 反义链(无意义链,负链):在 RNA 的转录中,用作模板的 DNA 链称为反义链( antisense 3.1RNA 的转录 3.1.1 转录的基本过程

无论是原核细胞还是真核细胞,转录的基本过程都包括:模板的识别、起始、延伸和终止。

启动子:与 RNA 聚合酶特异性结合以起始转录的一段 DNA 序列。终止子:引起转录终止的一段 DNA 序列。 增强子:调节启动子,增强转录效率的一段 DNA 序列。

1 )模板识别阶段主要指 RNA 聚合酶与启动子 DNA 双链相互作用并与之相结合的过程。

转录起始前,启动子附近的 DNA 双链分开形成转录泡以促使底物核糖核苷酸与模板 DNA 的配对。转录起始就是 RNA 链上第一个核苷酸 键的产生。

2 )转录起始后直到形成 9 个核苷酸短链,是通过启动子阶段,此时 RNA 聚合酶一直处于启动子区,新生的 RNA 链与 DNA 链的结合

不够牢固,很容易从 DNA 链上掉下来并导致转录重新开始。一旦 RNA 酶成功地合成 9 个以上核苷酸并离开启动子区,转录就进入正

常的延伸阶段。所以,通过启动子的时间代表一个启动子的强弱。一般来说,通过启动子的时间越短,该基因转录起始的频率也越高。 3 )延伸阶段:当 RNA 聚合酶离开启动子,沿 DNA 链移动并使新生 RNA 链不断伸长的过程就是延伸阶段。大肠杆菌 RNA 聚合酶的

活性一般是每秒钟合成 50 ~ 60 个核苷酸

4 )终止:当终止反应 包括识别特定的终止位点,碱基不再加到链上,转录复合物停止移动,酶和 RNA 从模板上释放。当 RNA 链延

伸到转录终止位点时, RNA 聚合酶不再形成磷酸二酯键, RNADNA 杂合物分离,转录泡瓦解, DNA 恢复成双链状态,而 RNA 聚合

酶和 RNA 链都被从模板上释放出来,这就是转录的终止。 真核细胞中模板的识别与原核细胞不同。

真核生物 RNA 聚合酶不能直接识别基因的启动子区,所以,需要一些被称为转录调控因子的辅助蛋白质按特定顺序结合于启动子上,

RNA 聚合酶才能与之相结合并形成复杂的前起始复合物( preinitiation transcription complex , PIC )以保证有效地起始转录。

转录和翻译的速度基本相等, 37 ℃ 时,转录生成 mRNA 的速度大约是每分钟 2 500 个核苷酸,即每秒钟合成 14 个密码子,而蛋

白质的合成速度大约是每秒钟 15 个氨基酸。

正常情况下,从一个基因开始表达到细胞中出现其 mRNA 的间隔约为 2.5 分钟,而再过 0.5 分钟就能在细胞内检测到相应的蛋白质。 3.1.2 转录机器的主要成分 3.1.2 .1 RNA 聚合酶

RNA 聚合酶主要以双链 DNA 为模板(若以单链 DNA 为模板,则活性大大降低),以四种核苷三磷酸为活化前体,并以 Mg2+/Mn2+ 为

辅助因子,催化 RNA 的起始、延伸和终止,它不需要任何引物。 RNA 聚合酶是转录过程中的关键酶。

原核和真核生物的 RNA 聚合酶虽然都能催化 RNA 的合成,但在分子组成、种类和生化特性上不同。 1.原核生物的 RNA 聚合酶

E.coliRNA 聚合酶的组成及各亚基的功能 E.coli 和其它原核细胞一样,只有一种 RNA 聚合酶。大肠杆菌的 RNA 聚合酶全酶由 5 种亚基α 2 ββ\\' w ζ组成,ζ因子与其它

部分的结合不是十分紧密,它易于与β\\'βα 2 分离,含有α 2 ββ\\' w 的酶称为核心酶,加上ζ亚基则成为全酶。五种亚基的功能

分别为:α亚基:可能与核心酶的组装及启动子识别有关,并参与 RNA 聚合酶和部分调节因子的相互作用。β亚基:含催化部位,起

催化作用,催化形成磷酸二酯键。 w 亚基:在全酶中存在,功能不清楚。β\\'亚基:与 DNA 模板结合功能。ζ亚基:识别起始位点。

它负责模板链的选择和转录的起始。

不同的原核生物,具有基本相同的核心酶,但其ζ亚基有所差别,决定了原核基因的选择性表达。 2.真核生物的 RNA 聚合酶真核生物中已发现有三种细胞核的 RNA 聚合酶,分别称为 RNA 聚合酶 I、II、III ,分子量大致都 在 50 万道尔顿左右。

它们专一性地转录不同的基因,因此由它们催化的转录产物也各不相同。 RNA 聚 I 合成 RNA 的活性最显著,它位于核仁中,负责转

录编码 rRNA 的基因。而细胞内绝大部分 RNA 是 rRNA 。

RNA 聚合酶 II ,位于核质中,负责核内不均一 RNA 的合成,而 hnRNA 是 mRNA 的前体。 RNA 聚合酶 III 负责合成 tRNA 和许多小的核内 snRNA 。

鹅膏蕈碱是真核生物 RNA 聚合酶特异性抑制剂,三种真核生物 RNA 聚合酶对鹅膏蕈碱的反应不同。 不同生物 3 类聚合酶的亚基种类和大小各异,但共性是: 1 )聚合酶中含有两个相对分子质量超过 1 × 105 的大亚基 ;

2 )同种生物 3 类聚合酶有“共享”小亚基的倾向,即有几个小亚基是其中 3 类或 2 类聚合酶所共有的。 3.1.2 .2 转录复合物

转录可被分成 4 个阶段: 启动子的选择(起始位点的识别)转录起始 链的延伸 转录终止 启动子的选择包括 RNA 聚合酶全酶对启动子的识别,聚合酶与启动子可逆性结合形成封闭复合物( closed complex )。此时, DNA 仍处于双链状态。

伴随着 DNA 构象上的重大变化,封闭复合物转变成开放复合物( open complex ),聚合酶全酶所结合的 DNA 序列中有一小段双链 被解开。

对于强启动子来说,从封闭复合物到开放复合物的转变是不可逆的,是快反应。开放复合物与最初的两个 NTP 相结合并在这两个核苷

酸之间形成磷酸二酯键后,即转变成包括 RNA 聚合酶、DNA 和新生 RNA 的三元复合物。 除了 RNA 聚合酶之外,真核生物转录过程中至少还需要 7 种辅助因子参与。 因为不少辅助因子本身就包含多个亚基,所以转录起始复合物的分子量特别大。 见表 34 真核生物 RNA 聚合酶 II 所形成的转录起始复合物( p69 )。 一般情况下,该复合物可以进入两条不同的反应途径:

* 一是合成并释放 2 ~ 9 个核苷酸的短 RNA 转录物,即所谓的流产式起始;

* 二是尽快释放ζ亚基,转录起始复合物通过上游启动子区并产生由核心酶、DNA 和新生 RNA 所组成的转录延伸复合物。

ζ因子的作用只是起始而已,一旦转录开始,它就脱离了起始复合物,而由核心酶负责 RNA 链的延伸。 因此,聚合酶全酶的作用是启动子的选择和转录的起始,而核心酶的作用是链的延伸。

转录延伸复合物是转录循环中十分重要的环节。与转录起始复合物相比,延伸复合物极为稳定,可长时间地与 DNA 模板相结合而不解

离。只有当它遇到转录终止信号时, RNA 聚合酶才停止加入新的核苷酸, RNADNA 杂合物解离,释放转录产物并导致聚合酶本身从 模板 DNA 上掉下来。

TF Ⅱ D 介导形成转录前起始复合物 (pre intitiationcomplex, PIC)RNA 聚合酶Ⅱ转录前起始复合体的形成示意图转录前先是 TF Ⅱ- D 与 TATA 盒结合① TF Ⅱ- A 结合在 TF Ⅱ- D 上游② TF Ⅱ- B 结合在转录起始位点附近③ RNA 聚合酶Ⅱ与 TF Ⅱ- F 偶联形成复合体结合到转录起始位点④ TF Ⅱ- E 结合在 RNA 聚合酶Ⅱ的下游⑤ TF Ⅱ- H 和 TF Ⅱ- J 结合上去,形成完整的

转录起始复合物和 TF Ⅱ- J 结合上去,形成完整的转录起 3.2 启动子与转录起始

大肠杆菌 RNA 聚合酶与启动子的相互作用主要包括启动子区的识别、酶与启动子的结合及ζ因子的结合与解离。

3.2.1 启动子区的基本结构

启动子:是一段位于结构基因 5 \\'端上游区的 DNA 序列,在转录起始之前被 RNA 聚合酶结合的 DNA 部位称为启动子。

转录的起始是基因表达的关键阶段,而这一阶段的重要问题是 RNA 聚合酶与启动子的相互作用。 启动子的结构影响了它与 RNA 聚合酶的亲和力,从而影响了基因表达的水平。

转录单元( transcription unit )是一段从启动子开始到终止子( terminator )结束的 DNA 序列, RNA 聚合酶从转录起点开始

沿着模板前进,直到终止子为止,转录出一条 RNA 链。 在细菌中,一个转录单元可以是一个基因,也可以是几个基因。

转录起点是指与新生 RNA 链第一个核苷酸相对应 DNA 链上的碱基,研究证实通常为一个嘌呤。 常把起点前面,即 5 \\'末端的序列称为上游( upstream ) ; 而把其后面即 3 \\'末端的序列称为下游( downstream )。

在描述碱基的位置时,起点为+ 1 ,下游方向依次为+ 2 ,+ 3 „„,上游方向依次为- 1 ,- 2 ,- 3 „„。

Pribnow 框( 10 序列)在转录开始位点上游 10 区域,大致在 4~ 13 之间有一个典型的 6bp 序列,大多为 TATAAT 或稍有变化

的形式,称为 Pribnow 框或 10 序列( TATA 区)。该共同序列的频度为: T 89A 89T 50A 65A 65T100 目前认为, Pribnow 框决

定着转录的方向,是 RNA 聚合酶牢固结合的位置。

35 序列( Sexfama box )在转录开始位点上游 35 区域也有一段保守序列,共同序列是 TTGACA ,称为 35 区。其保守频度为: T85T 83G 81A 61C 69A 52 下降突变:启动子里核苷酸的改变造成启动子效率降低。突变后的 10 区和 35 区越接近共同序列,转

录的 RNA 就越多;越远离共同序列,转录的 RNA 就越少。

在真核生物中, Hogne 等先在珠蛋白基因中发现了类似 Pribnow 区的 Hogne 区( Hogne box ),这是位于转录起始位点上

游- 25 ~- 30bp 处的共同序列 TATAAA ,也称为 TATA 区。

另外,在起始位点上游- 70 ~- 78bp 处还有另一段共同序列 CCAAT ,这是与原核生物- 35bp 区相对应的序列,称为 CAAT 区 ( CAAT box )。 3.2.2 启动子区的识别

一般认为, RNA 聚合酶并不直接识别碱基对本身,而是通过氢键互补的方式加以识别。

在启动子区 DNA 双螺旋结构中,腺嘌呤分子上的 N6、鸟嘌呤分子上的 N2、胞嘧啶分子上的 N4 都是氢键供体,而腺嘌呤分子上

的 N7、N3 ,胸腺嘧啶分子上的 O4、O2 ,鸟嘌呤分子上的 N7、O6、N3 和胞嘧啶分子上的 O2 都是氢键受体。

由于它们分别处于 DNA 双螺旋的大沟和小沟内,因此都具有特定的方位,而酶分子中也有处于特定空间构象的氢键受体与供体,当它

们与启动子中对应的分子在一定距离内互补时,就形成氢键,相互结合。这种氢键互补学说较为圆满地解释了启动子功能既受 DNA 序

列的影响,又受其构象影响这一事实。 3.2.3 酶与启动子区的结合

在 RNA 聚合酶与启动子相互作用过程中,聚合酶首先与启动子区闭合双链 DNA 相结合,形成二元闭合复合物,然后经过解链得到二

元开链复合物(图 38 , p74 )。

解链区一般在- 9 ~+ 13 之间,而酶与启动子结合的主要区域在其上游。一旦开链区解链,酶分子能以正确的取向与解链后的有关 单链相互作用,形成复合物。

因此, RNA 聚合酶既是双链 DNA 结合蛋白,又是单链 DNA 结合蛋白。 DNA 开链是按照 DNA 模板序列正确引入核苷酸底物的必要条件。 3.2.4 - 10 区和- 35 区的最佳距离

在原核生物中,- 35 区和- 10 区的距离大约是 16 ~ 19bp ,小于 15bp 或大于 20bp 都会降低启动子的活性。

保持启动子这两段序列以及它们之间的距离是十分重要的,否则就会改变它所控制的基因表达水平。 在细菌中常见两种启动子突变:

下降突变( down mutation ):如果把 Pribnow 其从 TATAAT 变成 AATAAT ,就会大大降低其结构基因的转录水平;

上升突变( up mutation ) : 即增加 Pribnow 区共同序列的同一性。

突变后的 10 区和 35 区越接近共同序列,转录的 RNA 就越多;越远离共同序列,转录的 RNA 就越少。 例如,在乳糖操纵子的启动子中,将其 Pribnow 区从 TATGTT 变成 TATATT ,就会提高启动子的效率,提高乳糖操纵子基因的转录水 平。 3.2.5 增强子及其功能

增强子( enhancer ):能强化转录起始的序列称为增强子或强化子

在 SV40 的转录单元上存在增强子,它位于转录起始位点上游约 200bp 处,为两段 72bp 的重复序列,它们不是启动子的一部分,但

能增强或促进转录的起始,除去这两段序列会大大降低这些基因的转录水平,若保留其中一段或将其取出插在 DNA 分子的任何部位, 就能保持基因的正常转录。

除 SV40 外,还在反转录病毒基因、免疫球蛋白基因、胰岛素基因、胰麋蛋白酶基因等许多基因的启动子区中陆续发现了增强子的存在

增强子很可能通过影响染色质 DNA 蛋白质结构或改变超螺旋的密度而改变模板的整体结构,从而使得 RNA 聚合酶更容易与模板 DNA 相结合,起始基因转录。

增强子的作用有以下特点: ①增强效应 非常明显②增强子提高同一条 DNA 链上基因转录效率,可以远距离作用,通常可距离

1 ~ 4kb、个别情况下离开所调控的基因 30kb 仍能发挥作用,而且在基因的上游或下游都能起作用。③增强子作用与其序列的正反 方向无关,将增强子方向倒置依然能起作用。④增强子要有启动子才能发挥作用,没有启动子存在,增强子不能表现活性。⑤但增强

子对启动子没有严格的专一性,同一增强子可以影响不同类型启动子的转录。⑥增强子必须与特定的蛋白质因子结合后才能发挥增强

转录的作用。⑦增强子一般具有组织或细胞特异性。 ⑧大多为重复序列。 沉默子 最早在酵母中发现,以后在 T 淋巴细胞的

T 抗原受体基因的转录和重排中证实这种负调控顺式元件的存在。目前对这种在基因转录降低或关闭中起作用的序列研究还不多,但

从已有的例子看到:沉默子的作用可不受序列方向的影响,也能远距离发挥作用,并可对异源基因的表达起作用。

3.2.6 真核生物启动子对转录的影响

启动子是指确保转录精确而有效地起始的 DNA 序列。

它是在 DNA 序列 5 \\'上游区有一段与原核生物 Pribnow 区相似的富含 TA 的保守序列。由于该序列前 4 个碱基为 TATA 区,所以又 称为 TATA 区( TATA box )。

真核基因的启动子在- 25 ~- 35 区含有 TATA 序列,在- 70 ~- 80 区含有 CCAAT 序列( CAAT box ),在- 80 ~- 110 含有 GCCACACCC 或 GGGCGGGG 序列( GC box )。

习惯上,将 TATA 区上游的保守序列称为上游启动子元件 (upstream promoter element , UPE) 或称上游激活序列( upstream activating sequence , UAS )。

原核和真核基因转录起始位点上游区的结构有很大差别(图 39 , p76 ):

1 )原核基因启动区范围很小,一般情况下, TATAAT ( Pribnow 区)的中心位于- 7 ~- 10 ,上游- 30 ~- 70 区为正调控

因子结合序列,+ 1 ~- 20 区为负调控因子结合序列;

真核基因的调控区较大, TATAA/TA 区位于- 20 ~- 30 ,而上游- 40 ~- 110 区为上游激活区。 2 )除 Pribnow 区之外,原核基因启动子上游只有 TTGACA 区(- 30 ~- 40 )作为 RNA 聚合酶的主要结合位点,参与转录调控; 而真核基因除了含有可与之相对应的 CAAT 区之外,大多数基因还拥有 GC 区和增强子区。 TATA 区和其它两个 UPE 区的作用有所不同: TATA 区:使转录精确地起始

UPE 区:对启动子的生物活性有很大影响

CAAT 区和 GC 区主要控制转录起始频率,基本不参与起始位点的确定。

CAAT 区对转录起始频率的影响最大,该区任一碱基的改变都将极大地影响靶基因的转录强度。 TATA 区和相邻的 UPE 区之间插入核苷酸也会使转录减弱。

GC 区、CAAT 区和 TATA 区都有重要功能,但不不是每个基因的启动子区都包含这三种序列。(表 35 , p77 )

基因转录实际上是 RNA 聚合酶、转录调控因子和启动子区各种调控元件相互作用的结果。 3.3 原核生物和真核生物 mRNA 的特征比较

信使核糖核酸( meenger RNA , mRNA )在大肠杆菌细胞中占总 RNA 的 2 %左右( tRNA 占 16 %, rRNA80 %以上)。

许多基因的 mRNA 在体内还是相当稳定的,半衰期从几个小时到几天不等。原核和真核细胞内 mRNA 的生物合成过程和成熟的 mRNA 的结构不同:

真核细胞 mRNA 的最大特点是它往往以一个较大相对分子质量的前体 RNA 出现在核内,只有成熟的、相对分子质量明显变小并经过化

学修饰的 mRNA 才能进入细胞质,参与蛋白质的合成。所以,真核细胞 mRNA 的合成和功能表达发生在不同的空间和时间范畴内。

原核生物中, mRNA 的转录和翻译不仅发生在同一个细胞空间里,而且这两个过程几乎是同步进行的,蛋白质合成往往在 mRNA 刚 开始转录时就被引发了。

一个原核细胞的 mRNA (包括病毒)有时可以编码几个多肽,而一个真核细胞的 mRNA 最多只能编码一个多肽。

原核生物常以 AUG (有时 GUG ,甚至 UUG )作为起始密码子,而真核生物几乎永远以 AUG 作为起始密码子。 3.3.1 原核生物 mRNA 的特征

1 )原核生物 mRNA 的半衰期短:转录开始 1min 后,降解就开始了,即当一个 mRNA 的 5 \\' 端开始降解时,其 3 \\' 端可能仍在合 成或被翻译。

mRNA 降解的速度大概只有转录或翻译速度的一半。

因为基因转录和多肽链延伸的速度基本相同,所以细胞内某一基因产物(蛋白质)的多少决定于转录和翻译的起始效率。

2 )许多原核生物 mRNA 以多顺反子的形式存在: 细菌 mRNA 可以同时编码不同的蛋白质。

单顺反子( monocistronic mRNA ) : 只编码一个蛋白质的 mRNA 。 多顺反子( polycistronic mRNA ):编码多个蛋白质的 mRNA 。

操纵子( operon ):多顺反子 mRNA 是一组相邻或相互重叠基因的转录产物,这样的一组基因称为一个操纵子,它是生物体内的重 要遗传单位。

几乎所有 mRNA 都可以被分成 3 部分:编码区、位于 AUG 之前的 5 \\'端上游非编码区以及位于终止密码子之后不翻译的 3 \\'端下游 非编码区。

对于第一个顺反子来说,一旦 mRNA 的 5 \\'端被合成,翻译起始位点即可与核糖体相结合,而后面几个顺反子翻译的起始就会受到 其上游顺反子结构的调控。

一种情况是,第一个蛋白质合成终止以后,核糖体分解成大、小亚基,脱离 mRNA 模板,第二个蛋白的翻译必须等到新的小亚基和大

亚基与该蛋白起始密码子相结合后才可能开始(图 312a,p80 )。

另一种情况是,当前一个多肽翻译完成后,核糖体分解成大、小亚基,小亚基也可能不离开 mRNA 模板,而是迅速与游离的大亚基结

合,启动第二个多肽的合成(图 312b,p80 )。

3 )原核生物 mRNA 的 5 \\' 端无帽子结构, 3 \\' 端没有或只有较短的 poly ( A )结构。 原核生物起始密码子 AUG 上游 7 ~ 12 个核苷酸处有一个 SD 序列( ShineDNAlgarno sequence )的保守区,因为该序列与

16SrRNA3 \\'端反相互补,所以被认为在核糖体 mRNA 的结合过程中起作用。

所有已知大肠杆菌 mRNA 的翻译起始区都含有 4 ~ 5 个(至少 3 个)对应于 SD 序列的核苷酸。 表 36 SD 序列的例子( p80 )。

细菌 16SrRNA 的 3 \\'末端既非常保守,又高度自我互补,能形成“发卡”结构(图 314 , p82 )。 3.3.2 真核生物 mRNA 的特征

“基因”的分子生物学定义:产生一条多肽链或功能 RNA 所必须的全部核苷酸序列。 真核生物 mRNA 结构上的最大特征是 5 \\'端的帽子及 3 \\'端的 poly ( A )结构。

1 )真核生物 mRNA 的 5 \\' 端的帽子结构,真核生物 mRNA 的 5 \\' 端大多具有 m7GPPPN 的帽子结构。 5 \\' 终端是在一个 mRNA 转

录后加上去甲基化的鸟嘌呤( G )。

mRNA 5 \\' 端加“ G ”的反应是由腺苷酸转移酶完成的,这个反应非常迅速。

据测算,在新生的 mRNA 链达到 50 个核苷酸之前,甚至可能在 RNA 聚合酶 II 离开转录起始位点之前,帽子结构就已加到 mRNA 的

第一个核苷酸上了。这就是说, mRNA 几乎一出生就戴上了帽子。

一般认为,帽子结构是 GTP 和原 mRNA5 \\'三磷酸腺苷(或鸟苷)缩合反应的产物,新加上的 G 与 mRNA 链上所有其它核苷酸方向

正好相反,像一顶帽子倒扣在 mRNA 链上,故而得名。

帽子结构可能使 mRNA 免遭核酸酶的破坏,而且,有帽子结构的 mRNA 更容易被蛋白质合成的起始因子所识别,从而促进蛋白质的

合成。 mRNA 的帽子结构常常被甲基化,由尿苷酸 7 甲基转移酶来催化。帽子结构的功能: • 对翻译起识别作用。②可以保护 mRNA 免遭核酸酶降解。不是所有的真核生物 mRNA 都有 5 \\'端帽子结构。 2 )绝大多数真核生

物 mRNA 具有 poly ( A )尾巴。除组蛋白基因外,真核生物 mRNA 的 3 \\'末端都有 poly ( A )序列,长度为 40 ~ 200bp 。几 乎所有真核基因的 3 \\'末端转录终止位点上游 15 ~ 30bp 处的保守序列 AAUAAA 对于初级转录产物的准确切割及加 poly ( A )是

必须的。 poly ( A )是 mRNA 由细胞核进入细胞质所必须的形式,它大大提高了 mRNA 在细胞质中的稳定性。当 mRNA 刚从细胞核

进入细胞质时,其 poly ( A )尾巴一般较长,随着 mRNA 在细胞质内逗留时间的延长, poly ( A )逐渐变短消失, mRNA 进入

降解过程。真核生物 mRNA 大都有 poly ( A )尾巴这一特性,广泛用于分子克隆。反转录反应。尽管大部分真核 mRNA 大都有

poly ( A )尾巴,细胞中仍有多达 1/3 没有 poly ( A )尾巴的 mRNA 。真核 mRNA 中 poly(A) 化必要的 2 个序列信号和切断位点:

human α globin UUGAAUAAAGUCUGAGUGGGCGGCAGCCUGUGUGUGCCUGGGUUCUCU human β globin CCUAAUAAAAAACAUUUAUUUUCAUUGCAAUGAUGUAUUUAAAUUAU human growth hormoneCCUAAUAAAAUUAAGUUGCAUCAUUGUCUGACUAGGUGUCCUC 真核基因大多是断裂的,也就是说,一个基因可由多个内含子和外显子间隔排列而成。 研究表明,内含子在真核基因中所占的比例很高,甚至超过 99 %。

由 DNA 转录产生的原始转录产物--核不均一 RNA ( hnRNA,heterogeneous nuclear RNA ),即 mRNA 的前体,经过 5 \\'加帽

和 3 \\'酶切加 poly ( A )尾,再经 RNA 的剪接,编码蛋白质的外显子部分就连接成为一个连续的可读框( open reading frame, ORF ),通过核孔进入细胞质,就能作为蛋白质合成的模板了。 3.4 终止和抗终止

一般情况下, RNA 聚合酶起始基因转录后,它就会沿着模板 5 \\'→ 3 \\'方向不停地移动,合成 RNA 链,直到碰上终止信号时才与模

板 DNA 相脱离并释放新生 RNA 链。

终止发生时,所有参与形成 RNADNA 杂合体的氢键都必须被破坏,模板 DNA 链才能与有义链重新组合成 DNA 双链。

3.4.1 不依赖于ρ因子的终止

模板 DNA 上存在终止转录的特殊信号--终止子,每个基因或操纵子都有一个启动子和一个终止子。

分子生物技术在微生物鉴定中的应用

摘要:微生物多样性是生物多样性的重要组成部分。由于微生物和 动、植物 相比, 存在着多种显著差异。而传统的基于微生物培养与纯种分离的技术具有很大的局限性,分子生物学及其有关技术的长足进展及其在为生物中的使用, 使微生物的研究进入了分子的阶段。

关键词:16SrDNA PCR 温度梯度电泳 变性梯度凝胶电泳 微生物包括了从原核到真核的不同类群的生物: 细菌、放线菌、原生动物、真菌、部分藻类和病毒, 是生物多样性的重要组成部分。此外, 微生物多样性与其他生物类群相比有许多独特之处, 包括: 1) 生存环境多样; 2) 生长、繁殖速度多样; 3) 营养、代谢类型多样; 4) 生活方式多样。因而, 微生物多样性的研究无论对于生态系统功能的完整理解, 还是对于微生物资源的利用和开发都具有特殊重要的意义[1]。微生物作为生态系统中极重要的一员, 对动植物的生长,生态系统中的能流和物质循环及环境污染物的降解和解毒等方面起着重要作用并且与人的生活健康息息相关。随着微生物的不断发现及研究,传统微生物技术越来越不能满足其发展的需要,最主要的不足是丢失了微生物的多样性, 许多报道都指出, 在自然环境中有相当多的菌种( 约90%99%) 用传统方法无法培养出来[2].这对于微生物基因组学研究来说是很不利的.,导致研究的片面性并且效率低下。而分子生物学技术则避开了传统微生物培养分离的环节, 而是采取直接从样品中抽取所含微生物总DNA, 然后通过16S rDNA, PCR, RAPD, DGGE

和RFLP 等多种分子生物学研究手段, 对直接提取的总DNA进行分析, 了解其中所包含的微生物DNA 的种类和含量, 以研究样品中微生物的实际组成, 同时可以利用直接提取得到的总DNA 建立基因文库, 并从中筛选有用的基因。由于是直接从样品中提取总DNA, 中间没有任何筛选性的过程, 因此, 所得DNA 能够准确地反映样品中微生物的实际情况, 避免了传统培养方法不能真实反映微生态实际情况的缺点, 也不会丢失样品中存在的任何微生物,同时, 这种方法能够很容易、大批量地取得同一环境下乃至不同环境下的不同微生物的同源基因, 为微生物比较基因组学研究开辟了道路.此外, 用直接提取的总DNA 构建的基因文库, 包含了大量以前因为无法培养而不能获得的微生物基因, 从这些文库中发现全新的具有巨大应用价值的抗生素类、酶类及其他生物活性物质的基因应该是非常有潜力的。 1.16SrRNA比较测序

16SrDNA是编码原核生物16SrRNA的基因,长度约1500bp,存在于所有的原核生物的基因组中,由多个保守区和与之相间的多个可变区组成。保守区为所有细菌共有,细菌之间无显著差异;可变区在不同细菌之间存在一定程度的差异,具有细菌属或种特异[3]。 2.PCR 近年来,对环境样品总DNA 进行PCR 扩增, 推动了利用分子标记技术研究微生物的多样性。PCR技术是美国letus公司人类遗传研究室的科学家与1983年发明的一种在体外快速扩增特异基因或DNA 序列的方法, 其目的是将极微量DNA大量扩增。该技术模仿生物体内DNA

的复制过程,首先使DNA 变性, 两条链解开;然后使引物模板退火, 二者碱基配对; 耐高温的Taq DNA 聚合酶以4种dNTP为底物, 在引物的引导下合成与模板链互补的DNA 新链[4]。PCR 技术可在体外快速扩增DNA, 具有快速、简便、灵敏度高的特点。当然常规 PCR技术也存在很多的问题,如出现假阳性、形成引物二聚体、传统的PCR技术一次扩增只能检测一种微生物、RNA病毒的PCR检测操作繁琐,中间污染环节多,易出现假阳性或假阴性结果等.为了弥补上面这些不足,一些新的PCR技术逐渐衍生出来并被用于实践,如热启动PCR、巢式PCR、逆转录PCR、多重PCR、通用引物PCR、PCR单链构象多态性分析、随机引物DNA 多态性扩增(RAPD)、限制性长度多态性分析(RFLP)、实时荧光PCR(realtime PCR)等[5]。 3.电泳分离及其显示方法

除过我们熟知的琼脂糖凝胶电泳并用溴乙锭( EB)染色方法和聚丙烯酰氨凝胶电泳( PAGE 分离)银染方法外, 还有一些通过特殊的电泳分离技术而建立的分子标记, 如变性梯度凝胶电泳( DGGE) , 可分离长度相同但是序列不同的DNA 片段的混合物。对于特异性引物PCR 扩增的环境微生物的16SrRNA 基因, 一般的电泳很难将序列不同的片段分开。DGGE胶在聚丙烯酰氨胶中添加了线性梯度的变性剂, 可以形成从低到高的线性梯度, 在一定温度下, 同一浓度的变性剂中, 不同序列的产物,其部分解链程度不同。DNA 解链程度不同决定其电泳的迁移率, 结果不同的产物在凝胶上分离开。在变性条件适当的情况下, 该技术能分辨一个碱基对。DGGE 技术在微生物群落结构

的研究、微生物种群的动态分析、富集培养以及分离物的分析、16SDNA 同源性的分析中得到广泛应用[6]。

温度梯度电泳( TGGE )是利用不同构象的分子具有不同的变 性温度来进行分离, 最先应用于DNA /RNA 的分子构象分析和序列变异分析, 是一种新出现的检测点突变的电泳技术, 其最大特点上具有高分辨能力。单链构象多态性( SSCP )也是根据不同的结构对DNA在凝胶中迁移速率影响很大, 结果不同序列的DNA 片段在凝胶上得以高分辨率的分离。 基因芯片可分为cDNA 芯片、寡核苷酸芯片及基因组芯片。在一定条件下, 载体上的核酸分子可以与来自样品的序列互补的核酸片段杂交。如果把样品中的核酸片段进行标记, 在专用的芯片阅读仪上就可以检测到杂交信号[7]。

分子生物学技术在环境微生物研究中的应用中rRNA 技术提供了一种摆脱传统的纯种培养方法而鉴定环境微生的途径,并已被广泛应用于微生物的各个领域。虽然当前,标准rRNA 技术的灵敏度还难以检测到低丰度的( 低于1/ 1 000)在群落中仅占很小比例的微生物种类, 从而使之在微生物生态以及环境学上的应用受到很大的限制。然而, rRNA 技术与其它的分子技术以及特别是与传统的纯种培养方法相结合, 具备分析微生物多样性的巨大潜力。随着这些新的分子方法的不断改进以及rRNA 数据库中序列信息的不断增加, 我们能探知更多的未知的微生物世界。

参考文献:

[1]杨永华,姚健.分子生物学方法在微生物多样性研究中的应用[J] .生物多样性,2000 8(3):337342.[2]李 红,周友兵,陈炳耀,胡锦矗.分子生物学技术在微生物多样性研究中的应用[J].河北大学学报( 自然版),2003 12(23).[3]朱诗应,戚中田.16SrDNA扩增及测序在细菌鉴定与分类中的应用[J] .微生物与感染,2013 8(2):104109.[4,7] 高小朋, 张欠欠, 任桂梅.分子生物学技术在环境微生物研究中的应用[J].延安大学学报(自然科学版),2008 9(27):2745.[5] 路则宝,白现广。分子生物学技术在微生物检验中的应用研究进展[J].红河学院学报,2013 4(1)3846. [6]雷正瑜.16RsDNA序列分析技术在微生物鉴定中的应用[J].湖北生态工程职业技术学院学报,2006 1(4):3545.

《分子生物学》教案

O

RNA加工与核糖核蛋白复合体 教学目的和要求

1 了解RNA加工类型

2理解真核生物mRNA加工

3掌握原核生物rRNA和 tRNA的加工 O1 rRNA加工与核糖体

RNA加工类型

常见的类型有:内切核酸酶和外切核酸酶对核苷酸的切除;3/ 端和5/ 端添加核苷酸;对碱基或糖苷的修饰

原核生物的 rRNA加工

转录物形成茎环结构并与蛋白质结合成核糖核蛋白复合物(RNP),然后进行修饰(如对A的甲基化修饰),随之由RNA聚合酶Ⅲ剪切释放5S、16S、23S前体分子,再由RNA酶M

5、M

16、M23分别在每一前体分子的3/ 端和5/ 端进行进一步剪切,释放出成熟的全长RNA分子

真核生物的 rRNA加工

哺乳动物47S前 rRNA经历了一系列剪切,先切去外部转录间隔区,再切去内部转录间隔区,释放32S和20S两个前RNA,最后释放18S、5.8S、28S rRNA。嗜热四膜虫 rRNA在加工过程中,其内含子可被自身RNA所切除,这种具有酶活性的RNA称为核酶

核糖核蛋白复合体(RNP) 特定蛋白与特定RNA形成的复合体叫RNP 原核生物核糖体

大肠杆菌70S核糖体由30S(21种蛋白质和5S rRNA)小亚基和50S(31种蛋白质和 23S、5S rRNA)大亚基构成

真核生物核糖体

80S核糖体包含60S大亚基(45种蛋白质、一个5S rRNA、一个5.8S rRNA和一个28S rRNA)和40S小亚基(30种蛋白质和18S rRNA) O2 tRNA的加工、RNA酶P和核酶

原核生物的 tRNA加工

转录物前体形成茎环结构→RNase E、F切割3/ 端→RNase D对3/ 端修剪→RNaseP 对5/ 端切除→RNase D再除去3/端的两个核苷酸→ tRNA进行碱基修饰

真核生物的 tRNA加工

内切酶先切去5/ 端的前导区和2个额外的3/ 端核苷酸,再由 tRNA核苷酸转移酶将5/ CCA3/ 序列加到3/ 端,切除内含子

核糖核酸酶P 剪切前 tRNA产生成熟的5/ 端。其RNA组分可单独行使内切核酸酶功能

核酶

可催化特定生化反应的RNA。RNaseP是可使 tRNA成熟的核酶。 O3 mRNA加工、hnRNP、snRNP

mRNA加工

原核生物的 mRNA不需要加工。真核生物的RNA聚合酶Ⅱ转录的基因大小长度不一,其转录产物的群体统称为核内不均一RNA(hnRNA),将被加工的 mRNA为前RNA,其加工包括:5/ 端加帽;3/ 端剪切及加polyA尾;剪接和甲基化

hnRNP 前RNA被蛋白质(主要是A、B、C)包裹形成核内不均一RNP(hnRNP) snRNP颗粒

富含U的核内小分子RNA与蛋白质形成snRNP颗粒,大部分参与前rRNA加工的甲基化位点定位

5/ 端加帽

5/ 端加上7甲基鸟苷,GMP以反方向加到RNA转录物上,形成5/5/ 三磷酸桥。帽子结构对5/ 外切核酸酶形成屏障

3/ 端剪切和加尾

3/ 端经过剪切再由聚腺苷酸聚合酶(PAP)加上poly(A)尾。可抵抗3/ 外切核酸酶的攻击,也助于 mRNA的翻译

剪接

切除内含子将外显子连接一起的过程,由U

1、U

2、U

4、U

5、U6snRNP催化。内含子有5/ GC和AG3/及一端分支点序列

前 mRNA的甲基化

常见的是A上N6的甲基化 O4 可变 mRNA加工

可变加工

在特定前mRNA上形成一种以上的mRNA。它包括可变剪接和可变poly(A)加工

可变poly(A)位点

采用不同的poly(A)位点可导致采用不同的剪接方式 可变剪接

利用不同的5/位、3/位剪接位点产生不同的mRNA RNA编辑

改变、插入或删除初始转录物特定部位的碱基而改变其核苷酸序列。

P 遗传密码与tRNA 教学目的和要求

1了解遗传密码的特性

2 掌握tRNA的结构和功能 P1 遗传密码

特性

4种核苷酸组成的三联体密码有64种,氨基酸只有20种,大多数氨基酸有多个密码子,因此遗传密码具有简并性

破译

利用随机共聚物加入无细胞体系来合成mRNA,可以确定密码子的构成 特征

编码同一氨基酸的密码子为同义密码子(蛋氨酸和色氨酸只有一个密码子),通常只是第3个碱基不同

突变效应

第3位的转换通常不改变氨基酸,第3位的颠换一半以上也是无效的。第2位的转换导致相似氨基酸的转变,颠换则改变氨基酸类型 通用性

甘肃中医志疗癫痫病好的医院>密码子在所有生物都通用

可读框

始于ATG止于终止密码的连续密码子区域,没有已知的蛋白产物,该区域为可读框,确定有蛋白产物时叫编码区

重叠基因

一个基因的编码区和另一个编码区重叠,病毒可利用该方式增加基因组的编码能力

P2 tRNA的结构和功能

tRNA的一级结构

含有许多修饰碱基,常见有4种:胸苷,假尿苷,二氢尿苷和肌苷。从5/ 到3/ 端分别形成D环、反密码子环、T环和接受臂

tRNA的二级结构

三叶草结构:氨基酸结合臂与氨基酸结合;D环—含二氢尿嘧啶;反密码子环—肌苷(I)可与同义密码子配对;可变臂;TψC臂和环;3/ 端有CCA结构 tRNA的三级结构 倒L 型

功能及氨酰化

tRNA与氨基酸结合为氨酰tRNA,由氨酰tRNA合成酶催化 氨酰tRNA合成酶 依赖

tRNA上的鉴别元件来识别不同

tRNA

《分子生物学》教案

一、课程性质

必修课

二、教学目的要求

分子生物学是一门近年来发展迅速并且在生命科学领域里应用越来越广泛、影响越来越深远的一个学科。从学科角度来讲,分子生物学函盖面非常广,与生物化学和细胞生物学等生命科学主干课程有一些交叉。在学习本课程之前,要求学生已掌握了必要的数、理、化知识,并学习了植物学、动物学、微生物学与生物化学等基础课程。

通过对本课程的学习,使学生掌握基因概念在分子水平上的发展与演变、基因的分子结构和特点、基因的复制、基因表达(在转录、翻译水平)的基本原理、基因表达调控的基本模式、基因发生突变与交换及DNA遗传多型性检测的分子生物学原理,了解新兴起的基因组学和后基因组学研究现状。通过与实验课相结合,系统地介绍与基因克隆相关的DNA技术,使学生们掌握一些基本的分子生物学技术。

教材及有关参考书

朱玉贤等,《现代分子生物学》高等教育出版社,2002 Benjamin Lewin编著

余龙等主译,《Gene Ⅷ》科学出版社,2005 赵寿元等,《现代遗传学》高等教育出版社,2001 孙乃恩等,《分子遗传学》南京大学出版社,1990

四、适用专业

生物科学、生物技术、生物工程、科学教育等专业

五、授课学时

36学时

六、课程内容

第一章

绪论

教学目的:使学生对分子生物学的发展简史、分子生物学的研究内容及发展前景有较全面的了解。

教学重点、难点:基因概念的发展与演变;对现代遗传学各发展阶段的认识。 课时安排:4学时 教学内容:

一、什么是分子生物学?

分子生物学是研究核酸、蛋白质等所有生物大分子的形态、结构特征及其重要性、规律性和相互关系的科学。

二、分子生物学的发展简史

从1847年Schleiden和Schwann提出\\\"细胞学说\\\",证明动、植物都是由细胞组成的到今天,虽然不过短短一百多年时间,我们对生物大分子细胞的化学组成却有了深刻的认识。孟德尔的遗传学规律最先使人们对性状遗传产生了理性认识,而Morgan的基因学说则进一步将\\\"性状\\\"与\\\"基因\\\"相耦联,成为分子遗传学的奠基石。Watson和Crick所提出的脱氧核糖酸双螺旋模型,为充分揭示遗传信息的传递规律铺平了道路。在蛋白质化学方面,继Sumner在1936年证实酶是蛋白质之后,Sanger利用纸电泳及层析技术于1953年首次阐明胰岛素的一级结构,开创了蛋白质序列分析的先河。而Kendrew和Perutz利用X射线衍射技术解析了肌红蛋白(myoglobin)及血红蛋白(hemoglobin)的三维结构,论证了这些蛋白质在输送分子氧过程中的特殊作用,成为研究生物大分子空间立体构型的先驱。

总结与分子生物学相关的诺贝尔奖。

三、分子生物学的主要研究内容 1. DNA重组技术基因工程

基因工程指将不同DNA片段(如某个基因或基因的一部分)按照人们的设计定向连接起来,在特定的受体细胞中与载体同时复制并得到表达,产生影响受体细胞的新的遗传性状。

DNA重组技术有着广阔的应用前景:

① 在生物技术制药领域中的应用。如:利用基因工程技术改造传统的制药工业;利用克隆的基因表达生产有用的肽类和蛋白质药物或疫苗。

②定向改造某些生物的基因组结构,使它们具备某些特殊的经济价值。 ③在基础研究中的应用。如:基因的克隆与分析;启动子分析。 2.基因表达调控

因为蛋白质分子参与并控制了细胞的一切代谢活动,而决定蛋白质结构和合成时序的信息都由核酸(主要是脱氧核糖核酸)分子编码,表现为特定的核苷酸序列,所以基因表达实质上就是遗传信息的转录和翻译。在个体生长发育过程中生物遗传信息的表达按一定的时序发生变化(时序调节),并随着内外环境的变化而不断加以修正(环境调控)。

原核生物的基因组和染色体结构都比真核生物简单,转录和翻译在同一时间和空间内发生,基因表达的调控主要发生在转录水平。真核生物有细胞核结构,转录和翻译过程在时间和空间上都被分隔开,且在转录和翻译后都有复杂的信息加工过程,其基因表达的调控可以发生在各种不同的水平上。基因表达调控主要表现在信号传导研究、转录因子研究及RNA剪辑3个方面。

3.生物大分子结构功能结构分子生物学

生物大分子的结构功能研究(又称结构分子生物学) 一个生物大分子,无论是核酸、蛋白质或多糖,在发挥生物学功能时,必须具备两个前提:首先,它拥有特定的空间结构(三维结构);其次,在它发挥生物学功能的过程中必定存在着结构和构象的变化。

结构分子生物学就是研究生物大分子特定的空间结构及结构的运动变化与其生物学功能关系的科学。它包括结构的测定、结构运动变化规律的探索及结构与功能相互关系的建立3个主要研究方向。最常见的研究三维结构及其运动规律的手段是X射线衍射的晶体学(又称蛋白质晶体学),其次是用二维核磁共振和多维核磁研究液相结构,也有人用电镜三维重组、电子衍射、中子衍射和各种频谱学方法研究生物高分子的空间结构。

4.功能基因组学与生物信息学研究

先后完成了包括从大肠杆菌、酿酒酵母到线虫等十余种模式生物基因组全序列的测定工作,并于2002年2月12日完成人类基因组测序工作。世界两大最著名的学术刊物-nature和science同时发表了人类基因组全序列。

基因组测序工作的进展是非常令人振奋的。 但是也随之产生了新问题。大

量涌出的新基因数据迫使我们不得不考虑这些基因编码的蛋白质有什么功能这个问题。在这些基因组中通常有一半以上基因的功能是未知的。因此读懂基因组称为后基因组时代的生命科学领域面临的巨大的挑战。

在功能基因组时代,应用生物信息学方法,高通量地注释基因组所有编码产物的生物学功能是一个重要的特征。生物信息学是在各种“组学”研究的推动下发展起来的.传统的研究方法是只研究某一个基因或蛋白质或转录产物,而“组学“的研究是采用高通量的技术分析细胞中全部的基因和蛋白质,这样势必会产生海量的信息,因此,人们必须寻求一种高速度、高效率、大规模的方式积累数据处理分析方法。

四、分子生物学展望 未来的发展方向:

不同模式生物基因调控网络的比较分析;RNA介导的基因表达调控网络;表观遗传(epigenetic)信息的整合;从数据整合到系统生物学(systems biology)。

第二章 遗传的物质基础-DNA 教学目的:使学生了解并掌握DNA的结构与功能

教学重点、难点:DNA的一级结构的测定,DNA的二级结构及超螺旋结构。 课时安排:4学时 教学内容:

第一节DNA的一级结构

一、一级结构的构成

所谓DNA的一级结构,就是指4种核苷酸的连接及其排列顺序,表示了该DNA分子的化学构成。核苷酸序列对DNA高级结构的形成有很大影响,如BDNA中多聚(GC)区易出现左手螺旋DNA(ZDNA),而反向重复的DNA片段易出现发卡式结构等。

二、一级结构的序列测定

目前所用的DNA测序方法是在末端终止法的基础上发展起来的。由英国科学家Sanger提出的。Sanger在生物大分子的序列测定方面做出了杰出贡献。他曾在1953年利用小片段重迭法成功测定了胰岛素51个氨基酸序列,并获得诺贝尔奖。1977年又利用末端终止法测定了X174噬菌体得DNA序列,第二次获得诺贝尔奖。

末端终止法又称为双脱氧法,基本原理是模拟体内DNA的复制过程在体外合成DNA,通过测定DNA片段的相对长度来推断核苷酸序列。

至于成分大家不要死记,可以回忆一下DNA复制过程需要哪几种组分:模板、dNTP、引物、DNA聚合酶,其中一种dNTP的磷酸基团用P32标记。除此之外还需要每个管中分别加入一种ddNTP。DDNTP是双脱氧核苷酸,由于在3位上缺少OH,无法与下一个单体之间形成磷酸二酯键,因此,一旦掺入DNA链的延伸后,便终止DNA的合成这样,在DNA聚合酶的作用下核苷酸链不断延伸,我们可以调整dNTP和ddNTP的浓度,使ddNTP在每个位置上都有一个掺入的机会。每个管都会产生一系列长短不一的DNA片段,其共同特征是末端的最后一个碱基是相同的。我们将所得的所有DNA片段进行凝胶电泳,长度不同,泳动的速度不同。8%20%的聚丙烯酰胺可将相差一个碱基的DNA片段区

分开,由于dCTP是放射性标记的,我们将凝胶放射自显影后,有DNA片段的位置就会显示出相应的信号带。自下而上依次将碱基序列读出。

第二节DNA的二级结构

一、二级结构的特点

DNA不仅具有严格的化学组成,还具有特殊的高级结构,它主要以有规则的双螺旋形式存在,其基本特点是:

1、DNA分子是由两条互相平行的脱氧核苷酸长链盘绕而成的;

2、DNA分子中的脱氧核糖和磷酸交替连接,排在外侧,构成基本骨架,碱基排列在内侧;

3、两条链上的碱基通过氢键相结合,形成碱基对,它的组成有一定的规律。这就是嘌呤与嘧啶配对,而且腺嘌呤(A)只能与胸腺嘧啶(T)配对,鸟嘌呤(G)只能与胞嘧啶(C)配对。如一条链上某一碱基是C,另一条链上与它配对的碱基必定是G。碱基之间的这种一一对应的关系叫碱基互补配对原则。组成DNA分子的碱基虽然只有4种,它们的配对方式也只有A与T,C与G两种,但是,由于碱基可以任何顺序排列,构成了DNA分子的多样性。例如,某DNA分子的一条多核苷酸链有100个不同的碱基组成,它们的可能排列方式就是4100。

二、变性、复性及杂交

变性:指双螺旋区氢键断裂,空间结构破坏,只涉及次级键的破坏。常用的DNA变性方法:热变性和用变性剂处理。

如何判断DNA是否发生变性了呢?常用的方法是测定DNA的光吸收值。在碱基的嘌呤环和嘧啶环中存在共扼双键,在240-290nm波长有一强烈的吸收峰,最大吸收值在260nm。(蛋白质由于存在肽键,在280nm有明显的吸收峰)当DNA变性时,有序的碱基排列被破坏,光吸收值显著增加,该现象称为增色效应。当缓慢增加DNA溶液的温度时,记录不同温度下的A260的数值,即绘制成DNA的变性曲线。以温度为横坐标,以A260为纵坐标。当A260增加到最大值的一半时,这时的温度称为DNA的溶解温度或熔点,Tm表示。

除此之外,光吸收法也是实验室定量测定DNA和RNA浓度和纯度的一种方法。从某种样品中提取了基因组DNA,可根据A260/A280的比值判断其纯度。

复性:变性核酸的互补链在适当条件下重新缔合成双螺旋的过程。

杂交:在退火条件下,带有互补核苷酸序列的单链DNA或RNA混合在一起,其相应的互补区段会形成双链结构。分子杂交是分子生物学常用的技术,可用来检测某一特定基因的时空表达情况和在基因组中的。

分子杂交最初是由Southern设计出来的。当时是用DNA探针检测的DNA,也就是DNA与DNA的杂交,人们就将这种方法称为是Southern blotting。在此基础上,人们设计出DNA探针检测RNA,称为Northern blotting。

基因芯片的工作原理与经典的核酸分子杂交方法(southern、northern)是一致的,都是探针和互补的靶基因结合,通过随后的信号检测进行定性与定量分析。基因芯片(DNA microarray)指将N个目的DNA用自动化设备点在固体支持物上,DNA经固化后,用不同颜色的荧光标记的探针对这些DNA同时进行杂交,根据杂交结果呈现的不同颜色,经计算机分析后得到关于N个基因表达情况的数据。

第三节DNA的高级结构

一、超螺旋结构及拓扑异构体

双螺旋DNA进一步扭曲盘绕则形成其三级结构,超螺旋是DNA三级结构的主要形式。自从1965年Vinograd等人发现多瘤病毒的环形DNA的超螺旋以来,现已知道绝大多数原核生物都是共价封闭环(covalently closed circle,CCC)分子,这种双螺旋环状分子再度螺旋化成为超螺旋结构(superhelix或supercoil)。有些单链环形染色体(如φ×174)或双链线形染色体(如噬菌体入),在其生活周期的某一阶段,也必将其染色体变为超螺旋形式。对于真核生物来说,虽然其染色体多为线形分子但其DNA均与蛋白质相结合,两个结合点之间的DNA形成一个突环(loop)结构,类似于CCC分子,同样具有超螺旋形式。超螺旋按其方向分为正超螺旋和负超螺旋两种。真核生物中,DNA与组蛋白八聚体形成核小体结构时,存在着负超螺旋。研究发现,所有的DNA超螺旋都是由DNA拓扑异构酶产生的。

二、拓扑异构变化的生物学意义

DNA拓扑异构的变化是DNA的复制和转录过程所必须的。

一个闭合的DNA 分子可以用其连环数进行描述,连环数(Linking number)

是指一条链空间跨越另一条链的次数。顺序相同的闭合DNA 分子可能有不同的连环数,这反映了超螺旋程度的差异。连环数不同的相同DNA 分子称为拓扑异构体(Topological isomers) 。

连环数由两个成分组成:缠绕数(Writhing number ,W) 和扭转数(Twisting number, T) 。扭转数T 是双链螺旋结构自身的一种性质,代表一条链绕另一条链旋转的双螺旋总圈数。它由每一圈配对的碱基数决定。对于平放在平面上的一个松弛的闭合环状DNA 来说,用碱基对的总数除以每一圈的碱基对数就是它的扭转数。

缠绕数W 代表双螺旋轴在空间上的弯曲,在直观上与超螺旋的概念相对应,但并非具有完全相同的数量上的定义或衡量。对于一个松弛分子,W=0 时连环数等于扭转数。我们经常用下面的公式计算连环数的变化量:

ΔL=ΔW+ΔT

第三章 染色体和基因

教学目的:使学生掌握基因组的概念、原核生物基因组的特点和真核生物染色体及基因组特点。

教学重点、难点:真核生物染色体的基本特征;卫星DNA及在分子标记中的应用;断裂基因;基因家族及串连重复基因簇。

课时安排:4学时 教学内容:

第一节基因组大小与C值矛盾

一、基因组概念

一个物种单倍体的染色体的数目,称为基因组。基因组中DNA 的总量是物种所特有的,称为C 值(Cvalue) 。C 值的范围变化很大,从微生物中的1011。图3.1 总结了进化中不同门类生物的C 值范围。随着复杂度增加,每组中最小基因组大小也会随着增加。

三、C值矛盾现象

单倍体基因组DNA 含量在低等真核生物中与形态复杂性有一定的正相关,但在高等真核生物中却非如此,它们的单倍体基因组DNA 含量变化不定。基因组大小与遗传复杂性并非线性相关,称为C 值矛盾(Paradox) 。它涉及到真核基因组绝对和相对的DNA 数量。例如,蟾蜍Xenopus 和人类基因组大小差不多,但是人类遗传发育上更为复杂。在表面复杂程度相似的种属间(见图) 也存在C 值矛盾,这个问题局限于一些种族内,昆虫、两栖和植物最为明显。在两栖中,最小的基因组

第二节原核生物染色体及基因

原核生物的DNA与稀疏的蛋白质结合,存在于类核体上,没有核膜包被。原核生物DNA分子小,基因排列紧密,空间利用率高。

1.功能上相关的几个结构基因前后相连,再加上一个共同的调节基因和一组共同的控制位点(启动子promoter、操纵子operator),在基因转录时协同动作,组成操纵元(operon)。介绍乳糖操纵元的结构、调控机制。 2.绝大部分为编码基因,并通常以单拷贝形式存在。 3.重叠基因

第三节真核生物的染色体

一、染色体的基本组成单位-核小体

真核生物的染色体(chromasome)在细胞生活周期的大部分时间里都是以染色质(chromatin)的形式存在的。

核小体是构成染色质的基本结构单位,使得染色质中DNA、RNA和蛋白质组织成为一种致密的结构形式。核小体由核心颗粒(core particle)和连接区DNA(linker DNA)二部分组成,在电镜下可见其成捻珠状,前者包括组蛋白H2A,H2B,H3和H4各两分子构成的致密八聚体(又称核心组蛋白),以及缠绕其上一又四分之三圈长度为146bp的DNA链;后者包括两相邻核心颗粒间约60bp的连接DNA和位于连接区DNA上的组蛋白H1(见图),连接区使染色质纤维获得弹性。核小体是DNA紧缩的第一阶段,在此基础上,DNA链进一步折叠成每圈六个核小体,直径30nm的纤维状结构,这种30nm纤维再扭曲成襻,许多襻环绕染色体骨架(Scaffold)形成棒状的染色体,最终压缩将近一万倍。这样,才使每个染色体中几厘米长(如人染色体的DNA分子平均长度为4cm)的DNA分子容纳在直径数微米(如人细胞核的直径为6-7μm)的细胞核中。

二、染色体的基本特征-端粒、着丝粒 1.着丝粒

在有丝分裂中,姊妹染色单位向细胞相反的两极移动。它们的运动依赖于染色体与微管(Microtubule) 的接触,在另一端与极相连接(微管组成细胞的纤丝体系,在有丝分裂期间它们把染色体与细胞的极相连)。在微管端部的两个区域连接着微管组织中心(Microtubule organizing centers,MTOCs) ,它位于染色体中心粒附近和两个极上。染色体上负责其在有丝分裂和减数分裂时分离的区域称为着丝粒

着丝粒的DNA顺序称为CEN顺序。CEN 区域中存在三种类型的序列元件(图): CDEⅠ是所有中心粒左侧边界变化很少的9bp 保守序列。CDEⅡ是所有中心粒中都存在的A?T 比例大于90% 的8090bp 长序列,其功能依赖于其长度而非准确序列,其成份是一些真核生物中短的随机重复(卫星)DNA 序列的遗迹,其碱基成分可能产生一些DNA 双螺旋结构上的特征性的弯曲。CDEⅢ是所有中心粒右侧边界的11bp 长的高度保守序列,此类元件的两侧序列保守性较低,对于中心粒功能可能是必需的(CDEⅢ在侧翼序列必需的情况下可能长于11bp) 。 2.端粒

通过断裂产生的染色体末端,会与其它染色体发生作用,然而天然染色体是稳定的,因此,染色体末端一定具有某种特殊结构,可以稳定染色体,该结构称为端粒。

我们可以用两个性质来定义端粒序列:必需存在于染色体的端部(或至少在线性DNA 分子的末端);它必需赋予线性分子稳定性。

许多低等真核生物基因组中的线性DNA 分子,其端粒结构都是已知的。同样类型的序列也在植物和人类中发现,所以端粒的构建似乎遵循着普遍的规律。每个端粒由一系列短的随机重复序列组成。所有端粒序列能写成Cn(A/T)m 的一般形式,其中n>1 而m 为14 ;3端具有单链尾,且富含GT。

端粒一方面可保护线性DNA免受核酸酶攻击,另一方面,利用用从头合成的方式加入重复,能抵消在染色体端部无法复制所导致的重复丢失。

讨论端粒与寿命的关系。

第四节真核生物的基因

一、真核生物基因组中包含非重复序列和重复序列

1.重复序列 在单倍体基因组里,这些序列一般只有一个或几个拷贝,它占DNA总量的40%-80%。多为结构基因。

2.中度重复序列 这类重复序列的重复次数在10-104之间,占总DNA的10%-40%。各种rRNA、tRNA 及组蛋白基因等都属这一类。该类基因一般不编码。 3.高度重复序列——卫星DNA 这类DNA只在真核生物中发现,占基因组的10%—60%,由6—100个碱基组成,在DNA链上串联重复几百万次。由于碱基

的组成不同,在CsCl密度梯度离心中易与其他DNA分开,形成含量较大的主峰及高度重复序列小峰,后者又称卫星区带(峰)。该类基因一般不转录。

小卫星和微卫星序列是由比卫星序列的重复序列单位更短的单位构成,其重复单位的长度分别为10~100bp和10bp,而重复序列单位的数目通常为5~50个,不同个体间重复序列单位数目变化很大。

在人类中小卫星位点是1-5kb的顺序,此顺序由长15100nt的重复单位组成。当将人类的总DNA提出后,用限制性内切酶切成不同长度的片断(各种小卫星上都没有酶切位点),然后以小卫星DNA中的特异顺序为探针进行Southern杂交,可发现阳性片断的长度各不相同。由于不同个体的这种串联重复的数目和位置都不相同,所以小卫星DNA的Southern杂交带谱就具有高度的个体特异性,人们就称其为DNA指纹分析技术(DNA fingerprints)。

二、断裂基因

大多数真核生物的基因(包括编码蛋白质、rRNA、tRNA的基因)由间隔的外显子(表现在最终RNA产物中的序列)和内含子(从初始转录物中去除的序列)组成。

“一条基因,一种蛋白质”应修正为“一种蛋白质,一条基因”。因为一些DNA序列编码一种以上蛋白质。

三、基因家族与基因簇

真核生物的基因组中有许多来源相同、结构相似、功能相关的基因,这样一组基因称为基因家族(gene family)。

同一基因家族的不同成员紧密排列在一起,称为基因簇(gene cluster)。但更多情况下是散布在不同染色体上。如:珠蛋白基因α、β、γ、δ。同一家族成员是由同一个祖先基因经过复制和变异传递下来的。

四、串连重复基因簇

串连重复基因出现在其产物被极度需要的情况下,如组蛋白基因、rRNA基因和tRNA基因。如:组蛋白基因,编码H1/H2A/H2B/H3/H4五种组蛋白的基因彼此靠近构成一个重复单位,这样的重复单位串连在一起。rRNA基因,真核生物中的5.8S/18S/28S rRNA(主体rRNA )基因组成重复单位,转录出一个45S

rRNA前体,然后通过转录后处理。此外,还有,tRNA基因也是串连重复排列,但各重复单位中的各tRNA可以不同。

五、假基因

基因组中因突变而失活的基因,它和同一家族的活跃基因在结构和DNA序列上有相似性。

第三章DNA复制

教学目的:使学生掌握DNA复制的机理及一般过程、复制的各阶段的主要生物学事件、复制的方式、复制的调控、DNA修复系统。

教学重点、难点:复制的机理;复制的起始;端粒的复制。 课时安排:6学时 教学内容:

第一节DNA复制的机理及一般过程

一、半保留复制

半保留复制:Watson和Crick在提出DNA双螺旋结构模型时即推测,DNA在复制时首先两条链之间的氢键断裂两条链分开,然后以每一条链分别做模板各自合成一条新的DNA链,这样新合成的子代DNA分子中一条链来自亲代DNA,另一条链是新合成的,这种复制方式为半保留复制。

1957年,梅塞尔和斯塔尔利用大肠杆菌(E.Coli)研究遗传物质DNA。在这项经典实验中,他们先将大肠杆菌放入只含有既氮15(氮14的同位素)的营养基中培养,然后将这些大肠杆菌转移到只含氮14的营养基中。提取不同培养代数细菌的DNA,用CsCl密度梯度离心。实验结果表明:在全部由15N标记的培养基中得到的15NDNA显示为一条重密度带位于离心管的管底。当转入14N标记的培养基中繁殖后第一代,得到了一条中密度带,这是15NDNA和14NDNA的杂交分子。第二代有中密度带及低密度带两个区带,这表明它们分别为15N14N-DNA和14N14NDNA。随着以后在14N培养基中培养代数的增加,低密度带增强,而中密度带逐渐减弱,离心结束后,从管底到管口,CsCl溶液密度分布从高到低形成密度梯度,不同重量的DNA分子就停留在与其相当的CsCl密度处,在紫外光下可以看到DNA分子形成的区带。为了证实第一代杂交分子确实是一半15NDNA-半14N-DNA,将这种杂交分子经加热变性,对于变性前后的DNA分别进行CsCl密度梯度离心,结果变性前的杂交分子为一条中密度带,变性后则分为两条区带,即重密度带(15N-DNA)及低密度带(14N-DNA)。它们的实验只有用半保留复制的理论才能得到圆满的解释。

二、半不连续复制

DNA双螺旋的两条链是反向平行的,因此,在复制起点处两条DNA链解开

成单链时,一条是5\\'→3\\'方向,另一条是3\\'→5\\'方向。当以这两条链为模板时,新生链延伸方向一条为3\\'→5\\',另一条为5\\'→3\\'。但生物细胞内所有催化DNA聚合酶都只能催化5\\'→3\\'延伸,这是一个矛盾。冈崎片段(Okaxaki fragments)的发现使这个矛盾得以解决。在复制起点两条链解开形成复制泡(replication bubbles),DNA向两侧复制形成两个复制叉(replication forks)。以复制叉移动的方向为基准,一条模板链是3\\'→5\\',以此为模板而进行的新生DNA链的合成沿5\\'→3\\'方向连续进行,这条链称为前导链(leading strand)。另一条模板链的方向为5\\'→\\'3\\',以此为模板的DNA合成也是沿5\\'→3\\'方向进行,但与复制叉前进的方向相反,而且是分段,不连续合成的,这条链称为滞后链(lagging strand),合成的片段即为冈崎片段。这些冈崎片段以后由DNA连接酶连成完整的DNA链。这种前导链的连续复制和滞后链的不连续复制在生物是普遍存在的,称为DNA合成的半不连续复制。

第二节复制的过程

复制的过程总的说来包括起始、延伸和终止三个阶段。

一、复制的起始

1.复制的起始原点

很多实验都证明:复制是从DNA分子上的特定部位开始的,这一部位叫做复制起始点(originof replication)常用ori或O表示。细胞中的DNA复制一经开始就会连续复制下去,直至完成细胞中全部基因组DNA的复制。DNA复制从起始点开始直到终点为止,每个这样的DNA单位称为复制子或复制单元(replicon)。在原核细胞中,每个DNA分子只有一个复制起始点,因而只有一个复制子,而在真核生物中,DNA的复制是从许多起始点同时开始的,所以每个DNA分子上有许多个复制子。

DNA复制起始点有结构上的特殊性,例如:大肠杆菌染色体DNA复制起始点Oric由422个核苷酸组成,是一系列对称排列的反向重复序列,即回文结构(palindrome),其中有9个核苷酸或13个核苷酸组成的保守序列,这些部位是大肠杆菌中DnaA蛋白识别的位置,大肠杆菌染色体DNA是环状双链DNA,它的复制是典型的“ζ”型复制(由于形状像希腊字母ζ,见下图)。从一个起点开始,同时向两个方向进行复制,当两个复制方向相遇时,复制就停止。而有些生物的DNA复制起始区是一段富含A·T的区段。这些特殊的结构对于在DNA复制起

始过程中参与的酶和许多蛋白质分子的识别和结合都是必须的。

2.复制的方向

3.DNA复制起始引发体的形成及所参与的酶和蛋白质

解链酶:DNA开始复制时首先在起始点处解开双链,反应是在一种解链酶(helicase)的催化下进行的。解链酶需要ATP分解供给能量。大肠杆菌中DnaB蛋白就有介链酶活性,与随从链的模板DNA结合,沿5\\'→3\\'方向移动,还有一种叫做Rep蛋白和前导链的模板DNA结合沿3\\'→5\\'方向移动。解链酶的作用就是打开DNA双链之间的氢键。

单链结合蛋白质:它与解开的单链DNA结合,使其稳定不会再度螺旋化并且避免核酸内切酶对单链DNA的水解,保证了单链DNA做为模板时的伸展状态,SSBP可以重复利用。

DNA复制起始的关健步骤是前导链DNA的合成,一旦前导链DNA的聚合作用开始,随从链DNA的合成也随着开始。由于前导链的合成是连续进行的,所以它的起始相对简单,而随从链的合成是不连续进行的,所以引发阶段比较复杂。大肠杆菌的引发前体由DnaB.DnaC和单链结合蛋白组成。

引物酶

是一种特殊的RNA聚合酶,可催化短片段RNA的合成。这种短RNA片段一般十几个至数十个核苷酸不等,它们在DNA复制起始处做为引物。RNA引物的3\\'OH末端提供了由DNA聚合酶催化形成DNA分子第一个磷酸二酯键的位置。高度解链的模板DNA与多种蛋白质因子形成的引发前体促进引物酶结合上来,共同形成引发体,引发体主要在DNA随从链上开始,它连续地与引物酶结合并解离,从而在不同部位引导引物酶催化合成RNA引物,在引物RNA的3\\'OH末端接下去合成DNA片段,这就是随从链不连续合成的开始。

二、DNA的延伸

由DNA聚合酶催化完成。1957年,Arthur kornberg首次在大肠杆菌中发现DNA聚合酶Ⅰ,(DNA polymerase Ⅰ,简写DNA polⅠ)后来又相继发现了DNA聚合酶Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ ,其中主要的复制酶是DNA聚合酶Ⅲ。当聚合酶的一个亚基连续合成先导链时,另一个亚基在模板链所形成的大单链环中,循环式起始、终止后随链上冈崎片段的合成。真核生物的NA聚合酶可分为复制所需的

酶如:α、δ、ε、γ和损伤修复所需的酶β、δ、ε、η、θ,其中, DNA聚合酶α起始DNA链的合成, DNA聚合酶δ延伸先导链,另一个DNA聚合酶δ或ε延伸后随链。 DNA聚合酶γ负责线粒体DNA的复制。

真核生物线性DNA末端的端粒是怎样合成的呢?四膜虫抽提物中有一种酶,称端粒酶(Telomerase),它使用端粒链的G+T 的3OH 作为引物合成随机的TTGGGG 重复。此反应只需要dGTP 与dTTP。端粒酶是一个大的核糖核蛋白,它含有一个短RNA 组分,四膜虫中长159nt 而在Euplotes 中长192nt 。每个RNA 都含有一个1522nt 的序列和一个富含C 的重复序列的重复相同。这种RNA 为合成富含G 的重复序列提供模板。

三、复制的终止

当子链延伸达到terminus region(ter,带有多个20bp序列)时,DNA复制就终止了。Ter有点像一个陷井(trap),使复制叉只能进入,不能出来。Ter的功能主要是由TerTus复合物(ter utilization substance)来完成的。

第三节 复制的方式

一、线状DNA的复制方式 1.中间起始:如前所述.2.末端起始:腺病毒的形态是特征性的二十面体病毒壳体,腺病毒基因组是一个线性的双链DNA,其5’端与一种末端蛋白(TP)共价结合(Rekosh et al., 1977),5’端上还具有末端反向重复序列(ITRs)。

在腺病毒的每个5末端都共价连接一个55Kda的蛋白质,该蛋白质称为末端蛋白质(terminal protein TP),以其丝氨酸羟基通过磷酸二酯键与5端的胞嘧啶共价连接。TPC核苷酸的自由末端3OH通过DNA聚合酶引导延伸反应。这就产生了一条新链,其5‘末端与起始核苷酸C共价相连。

二、环状DNA的复制方式

1.复制:具有双链环状DNA分子的细菌和病毒所采用的复制方式。DNA在复制原点解开成单链状态,分别作为模板,合成其互补链,则出现两个叉子状的生长点,叫做复制叉,因此也称为复制叉式复制。可双向or单向,若是双向,可等速or不等速。

2.滚环复制:随后缺口产生的自由3’OH末端被聚合酶延伸。新合成的链取代

原母链。

这种结构被称为滚环,因为延伸点围绕环形模板链滚动,形成一个多聚单链的尾巴。当这条链甩到一定程度时开始以半不连续的方式合成其互补链。

滚环复制在噬菌体中普遍存在。例如:噬菌体φX174含有单链环形DNA,称为正(+)链。在复制前首要合成其互补链即负()链,产生了双链环形DNA分子,以滚环方式复制。

噬菌体的基因组编码的A蛋白结合在复制原点,在正链上产生切断磷酸二酯键。切割后A蛋白仍然与5’末端相连,而3’末端则在DNA聚合酶的作用下延伸。SSB蛋白不断地结合到甩出的单链上,并改变其构型,趋向环化。当被置换链达到一个单位长度时,A蛋白可识别复制原点,将链切断,进一步将切下的单位的长度的DNA环化。A蛋白释放,开始另一循环。环化后被取代的正(+)链可以作为模板合成互补负(—)链或被包裹到病毒体中。

另外,滚环复制为基因扩增提供了一种方式。见《分子遗传学》P109110。 3.D环复制:

真核生物线粒体DNA的复制方式。线粒体的H和L链上各有一个复制原点,在复制开始时,H链起始位点的复制像通常一样通过转录激活过程。RNA聚合酶转录出的RNA可作为引物,再由DNA聚合酶在引物的3’末端进行DNA聚合反应。随着链的延伸,新合成的L链取代了亲本L链,而产生一个替换环,称为D环。D环不断伸展,当伸展到环三分之二处时,被取代的L链上的复制起始点暴露出来,随后由特异的引发酶在该位点合成一段RNA引物,开始H链的复制。由于启动的延迟,当新L链合成结束时,新H链合成仅绕环三分之一圈。这样就释放出一个完整的双链环和一个开环结构。

第四节 复制的调控

一、原核生物复制的调控

原核生物复制的起始主要是由起始位点的甲基化状态来控制的。起始位点的A可被Dam甲基化酶所甲基化。在复制之前,起始位点的两条链都被甲基化,而复制后产生的DNA是半甲基化的。半甲基化的子链起始点只有在它们重新全部甲基化后才有起始功能。

二、真核生物复制的调控

在真核生物中,DNA的复制同样受到细胞周期的严格控制。在每一个起始点都需要执照因子来起始复制。执照因子是一种特殊的蛋白质,不能随意的穿越核膜。它在复制之前就已存在于细胞核中,一轮复制就会将这个因子失活或破坏。而细胞质中的执照因子也不能进入,因此DNA的复制不会被重复起始。只有在细胞发生有丝分裂期间,核膜发生破裂,执照因子才趁机进入核内,DNA的复制才可被起始。这样,就保证了复制的起始必须在经历整个细胞分裂过程之后才能重新发生。

第五节DNA的修复系统

一、复制修复

1、错配修复系统:错配矫正酶、Pol Ⅰ、DNA连接酶

2、尿嘧啶糖基酶系统:尿嘧啶-N-糖基酶、AP内切酶、Pol Ⅰ、DNA连接酶

二、损伤修复

1、光复活:在可见光的活化之下由光复活酶催化胸腺嘧啶二聚体分解成单体的过程。

2、切除修复:修复内切酶能识别引起DNA双螺旋变性的损伤,由UvrA、UvrB和UvrC三种亚基构成

3、重组修复:RecA具有催化DNA分子之间同源联会和交换单链的功能。

4、SOS修复:允许新生的DNA链越过TT二聚体而生长,其代价时保真度极大降低。SOS修复是导致突变的修复,它的介入时紫外线诱导突变的主要原因。

第五章 转录

教学目的:使学生掌握RNA合成的酶学特征、启动子的结构、转录的过程、转录后加工过程及逆转录。

教学重点、难点:启动子结构;RNA的剪接;核酶。 课时安排:6学时 教学内容:

第一节RNA合成的酶学

执行生命功能、表现生命特征的主要物质是蛋白质分子。DNA贮存着决定生物特征的遗传信息,只有通过蛋白质才能表达出它的生命意义,直接决定蛋白质合成及蛋白质特征的不是RNA而是DNA,因而人们确定DNA是遗传信息贮存者后就推测DNA是通过RNA去决定蛋白质合成的。50年代末RNA聚合酶的发现开始证实了这一推测。

以DNA为模板合成RNA的过程称为转录(transcription),由RNA聚合酶催化完成。

一、RNA合成的基本特征

RNA的转录合成从化学角度来讲类似于DNA的复制,多核苷酸链的合成都是以5\\'→3\\'的方向,在3\\'OH末端与加入的核苷酸磷酸二酯键,但是,由于复制和转录的目的不同,转录又具有其特点:(1)对于一个基因组来说,转录只发生在一部分基因,而且每个基因的转录都受到相对独立的控制;(2)转录是不对称的;(3)转录时不需要引物,而且RNA链的合成是连续的;(4)都以四种三磷酸核苷的底物;(4)RNA聚合酶缺乏3\\'→5\\'外切酶活性,所以没有校正功能。

二、原核生物的RNA聚合酶

大肠杆菌RNA聚合酶的研究得比较透彻的,这是一个分子量达50多万,全酶由五咱亚基组成,去掉δ亚基的部分称为核心酶,核心酶本身就能催化苷酸间磷酸二酸键形成。利福平和利福霉素能结合在β亚基上而对此酶发生强烈的抑制作用。β亚基似乎是酶和核苷酸底物结合的部位。细胞内转录是在DNA特定的起始点上开始的,δ亚基的功能是辨认转录起始点的。β\\'亚基是酶与DNA模板结合的主要成分。α亚基可能与转录基因的类型和种类有关。

二、真核生物的RNA聚合酶

真核生物中已发现有四种RNA聚合酶,分别称为RNA聚合酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和线粒体RNA聚合酶,分子量大致都在50万道尔顿左右,它们专一性地转录不同的基因,因此由它们催化的转录产物也各不相同。RNA聚Ⅰ合成RNA的活性最显著,它位于核仁中,负责转录编码rRNA的基因。而细胞内绝大部分RNA是rRNA是RNA。RNA聚合酶Ⅱ,位于核质中,负责核内不匀一RNA的合成,而hnRNA是mRNA的前体。RNA聚合酶Ⅲ负责合成tRNA和许多小的核内RNAs。鹅膏蕈碱是真核生物RNA聚合酶特异性抑制剂,三种真核生物RNA聚合酶对鹅膏蕈碱的反应不同。原核生物靠RNA聚合酶就可完成从起始、延长、终止的转录全过程,真核生物转录除RNA聚合酶外还需另一此叫做转录因子的蛋白质分子参与转录的全过程,

第二节控制转录起始的DNA序列-启动子的结构

一、原核生物启动子的结构

Pribnow框:在起始点上游,几乎在所有启动子都存在一个6 bp富含A/T区域TATAAT。通常位于-18位到-9位,称为Pribnow框。该区域是RNA聚合酶牢固结合位点,RNA聚合酶结合后,这一富含A/T的DNA双链解开。

Sextama框:位于-35区附近有一TTGACA序列,是RNA聚合酶中的ζ因子识别位点。以上这两个位点对于转录起始都是非常重要的。ζ因子识别-35区并与之结合。由于RNA聚合酶分子覆盖面积能达到70bp,因此酶分子上的一个合适部位能接触-10区。酶分子一旦与-10区结合以后,就从识别位点上解离下来。此外,-35序列的重要性还在于在很大程度上决定了启动子的强度。。

在-35区和-10区之间的碱基序列不特别重要,但是这两个序列之间的距离却十分重要,是决定启动子强度的因素之一大多为15 bp~20 bp。

二、真核生物启动子的结构

有三种类型的启动子,其中Ⅱ类启动子最为复杂。

Ⅱ类启动子由核心元件(core element)和上游启动子元件(upstream promoter element,UPE)组成。核心元件包括TATA框和转录起始位点。mRNA的第一个碱基倾向A,另一侧翼由Py组成。TATA框合又称Hogne框,GoldbergHogne框,其一致序列是:T85A97T93A85A63A83A50,常在起始位点的上游25左右,相当于原核的10序列。

上游元件包括CAAT box、GC box、等。如CAAT box一般位于上游75bp左右,紧靠80,其功能是控制转录起始活性。 远端调控区较常见的是增强子。

启动子Ⅲ位于起始位点的下游的转录区内,因此称为下游启动子(downstream promoter)或基因内启动子(intragenenic promoter)。转录需要转录因子TFⅢA、B和C的参与。

三、鉴定启动子的方法

1、足迹法:是一种测定DNA结合蛋白在DNA上的结合位点的实验方法,其根据是DNA的这些区域在结合有蛋白质时可被保护而免受核酸内切酶的作用.酶切后产生片段与对照的酶切片段经凝胶电泳分离后进行比较,即找出DNA与蛋白质结合的位点。

2、缺失分析和点突变:对以上所获得的DNA与蛋白质结合的位点进一步做缺失分析和点突变。

第三节转录的过程

一、转录起始

转录是从DNA分子的特定部位开始的,这个部位也是RNA聚合酶全酶结合的部信这就是启动子。为什么RNA聚合酶能够仅在启动子处结合呢?显然启动子处的核苷酸序列具有特殊性,为了方便,人们将在DNA上开始转录的第一个碱基定为+1,沿转录方向顺流而下的核苷酸序列均用正值表示;逆流而上的核苷酸序列均用负值表示。

在原核生物中,当RNA聚合酶的δ亚基发现其识别位点时,全酶就与启动子的35区序列结合形成一个封闭的启动子复合物。由于全酶分子较大,其另一端可在到10区的序列,在某种作用下,整个酶分子向10序列转移并与之牢固结合,在此处发生局部DNA1217r 的解链形成全酶和启动子的开放性复合物。在开放性启动子复合物中起始位点和延长位点被相应的核苷酸前体充满,在RNA聚合酶β亚基催化下形成RNA的第一个磷酸二酸键。RNA合成的第一个核苷酸总有GTP或ATP,以GTP常见,此时δ因子从全酶解离下来,靠核心酶在DNA链上向下游滑动,而脱落的δ因子与另一个核心酶结合成全酶反复利用。

真核生物转录起始十分复杂,往往需要多种蛋白因子的协助,已经知道,在

所有的细胞中有一类叫做转录因子的蛋白质分子,它们与RNA聚合酶Ⅱ形成转录起始复合物,共同参与转录起始的过程。真核生物基因中,有专门为蛋白质编码的基因,这些基因由RNA聚合酶Ⅱ负责进行转录起始关键性作用。根据这些转录因子的作用特点可大致分为二类;第一类为普遍转录因子它们与RNA聚合酶Ⅱ共同组成转录起始复合物,转录才能在正确的位置上开始。普遍转录因子是由多种蛋白质分子组成的,其中包括特异结合在TATA盒上的蛋白质,叫做TATA盒结合蛋白,还有至成一组复合物叫做转录因子ⅡD。TFⅡD再与RNA聚合酶Ⅱ结合完成转录起始复合物的形成。除TFⅡD以外,在细胞核提取物中还发现TFⅡA,TFⅡF,TFⅡE,TFⅡH等,它们在转录起始复合物组装的不同阶段起作用。从中也不难看出真核细胞中基因转录的起始是基因的表达调控的关键,这么多蛋白质分子之间相互作用,以及这些蛋白质分子DNA调控无件相结合,构成控制基因转录开始的复杂体系。第二类转录因子为组织细胞特异性转录因子或者叫可诱导性转录因子,这些TF是在特异的组织细胞或是受到一些类固醇激素,生长因子或其它刺激后,开始表达某些特异蛋白质分子时,才需要的一类转录因子。

二、转录延伸

RNA链的延长靠核心酶的催化,在起始复合物上第一个GTP的核糖3\\'OH上与DNA模板能配对的第二个三磷酸核苷起反应形成磷酸二酯键。聚合进去的核苷酸又有核糖3\\'OH游离,这样就可按模板DNA的指引,一个接一个地延长下去。因此RNA链的合成方面也是5\\'→3\\'。由于DNA链与合成的RNA链具有反平行关系,所以RNA聚合酶是沿着DNA链3\\'→5\\'方向移动。整个转录过程是由同一个RNA聚合酶来完成的一个连续下断的反应,转录本RNA生成后,暂时与DNA模板链形成儿童癫痫治疗费用大吗DNA·RNA杂交体,长度约为12个碱基对,形成一个转录泡(见图)。

转录速度大允是每秒钟3050个核苷酸,但并不是以恒定速度进行的。

三、转录终止

提供终止信号的序列称为终止子(terminator)。内源性终止子的回文结构中富含GC,且回文结构的下游有连续6~8个AT碱基对;弱终止子有回文结构,但不具有强终止子的两点特征,需要依赖于ρ因子实现终止作用。

ρ因子(终止因子) :是协助RNA聚合酶识别终止信号的辅助因子,属于ATP依赖的解旋酶家族,具有一个RNA结合域和ATP水解域。

第四节转录后加工

转录后加工是指将各种前体RNA分子加工成各种成熟RNA的过程。

一、真核生物mRNA的5Cap 真核生物细胞mRNA的5 ¢端加帽是在鸟苷转移酶的催化下通过5- 5键把一个G加到转录物的末端碱基形成的,随后,进行甲基化产生Cap0,Cap1,Cap2。

5帽子的生物学功能:在翻译过程中起识别作用以及对mRNA起稳定作用。

二、真核生物mRNA的3Tail 有这种特征的mRNA 称为poly(A)+,不具有的称为poly(A)-。 mRNA 3端的多聚A是由poly(A) 聚合酶所催化添加的。注意:多聚A尾巴不是添加在转录终止的3端。

三、RNA的拼接

内含子剪接和剪切(clearvage)是mRNA转录后加工中最为复杂的一环,也是近年来发展很快的研究领域之一。不同内含子的剪切和剪接,其机制,类型和酶都不完全相同,现分述如下。

1、Ⅰ类内含子的结构特点是:①其边界序列为5′ U↓„„ G↓3′(↓表示剪切位点);②具有中部核心结构(Central core strucature)。③具有内部引导序列(internal guide sequence IGS)。

首先是GTP进入G结合位点,左边外显子的3′端通过和引导序列的互补配对进入底物位点。GTP的3′OH作用左边外显子和内含子交界处的磷酸二酯键,本身结合到内含子的5′末端,被切下的5′外显子仍保持在底物位点上,并未游离。第二步内含子的G414(即3′交界序列上的G)又进入了G结合位点,切下的外显子的3′OH又对G结合位点上的G与3′外显子之间的磷酸二酯键发动亲核进攻,切开磷酸二酯键,而其3′OH和3′外显子的P重新形成磷酸二酯键而连接起来,这样就完成内含子的剪接。内含子成为线形的413nt的RNA分子。第三步,内含子5′端和引导序列相邻的序列通过引导序列互补配对,进入底物位点。仍然留在G结合位点上的G414其3′OH再作用底物位点

上的序列,切下19nt的内含子5′端,并和余下内含子的5′P形成二酯键,形成414nt的环状内含子。

2、Ⅱ型内含子在植物和低等真核生物的细胞器基因组中发现。Ⅱ类内含子的剪接和I类内含子不同。

结构特点是列为5′↓GUGCG„„YnAG↓,符合GTAG法则,在内含子的近3′端具有分支点顺序(branchpoint seguence),内部具有二级结构。

II型内含子的剪切无需鸟苷的辅助,但需镁离子的存在。首先是分枝点A的2′OH对5′端外显子和内含子交界处的磷酸二酯键发动亲核进攻(图1328)切下外显子1,内含子5′的边界序列上的G与5′磷酸和分枝点A的2′OH形成磷酸二酯键,从而产生了套索(lariat)结构;第二步是切下的外显子1,其3′OH继续对内含子3′端的交界序列进行亲核进攻,切下的外显子2′的5′磷酸和外显子1的3′OH形成磷酸二酯键,连接在一起,同时释放出套索状的内含子。

通过对以上两种内含子的研究,提出“核酶”概念。

核酶(Ribozyme)有的译成为核糖拟酶,核酶等,目前尚无统一的译法,暂以核酶称之,既简单明确,也能反映其酶的本质。核酶是T.Cech等(1981年)在研究四膜虫rRNA时发现的,1982年T.Cech将核糖核酸(ribonucleic acid)和酶(enzyme)这两个词“重组”成一个新的词:“Ribozyme”,它是指本质为RNA或以RNA为主含有蛋白质辅基的一类物质,这类物质具有催化功能,但和酶又有区别,主要表明在两个方面:①一般的酶是纯的蛋白质,而核酶是RNA或带有蛋白的RNA;②核酶既是催化剂又是底物,随着反应的进行,本身也消失了。而酶却不同,仅催化反应,反应前后其本身的质和量都不发生改变。

3、核mRNA的剪接

结构和Ⅱ类内含子十分相似,符合GUAG法则,具有分支位点。但根本的不同点是核mRNA前体的剪接本身不能形成二级结构,必需依赖于snRNP(U1,U2,U4,U5,U6)的帮助才能形成剪接体,进行自我剪接。它们自己本身不能象I类及Ⅱ类内含子那样依赖核心结构,形成茎环,将5′和3′剪切点拉在一起。和snRNA的结合是相当复杂的,但剪接反应的第一步5′位点的剪接是由U6催化的,3′位点是由5′外显子1的3′OH对内含子3′端切点进行转酯

反应来完成。

4.相关概念

可变剪接;反式剪接;RNA编辑

第五节逆转录

逆转录:RNA指导的DNA合成,在逆转录酶的作用下完成,如AMV, MLV。主要存在于RNA病毒中。

第六章 翻译

教学目的:使学生掌握tRNA的结构、遗传密码的特征、核糖体的结构及肽链的合成过程。

教学重点、难点:肽链的合成过程;rRNA在肽链合成中的催化作用。 课时安排:6学时 教学内容:

基因的遗传信息在转录过程中从DNA转移到mRNA,再由mRNA将这种遗传信息表达为蛋白质中氨基酸顺序的过程叫做翻译。翻译的过程也就是蛋白质分子生物合成的过程,在此过程中需要200多种生物大分子参加,其中包括核糖体、mRNA、tRNA及多种蛋白质因子。

第一节tRNA和遗传密码

一、tRNA的结构

tRNA在蛋白质生物合成过程中起关键作用。mRNA推带的遗传信息被翻译成蛋白质一级结构,但是mRNA分子与氨基酸分子之间并无直接的对应关系。这就需要经过第三者“介绍”,而tRNA分子就充当这个角色。tRNA是类小分子RNA,长度为7394个核苷酸,tRNA分子中富含稀有碱基和修饰碱基,tRNA分子3\\'端均为CCA序列,氨基酸分子通过共价键与A结合,此处的结构也叫氨基酸臂。每种氨基酸都有26种各自特异的tRNA,它们之间的特异性是靠氨基酰tRNA合成酶来识别的。这样,携带相同氨基酸而反密码子不同的一组tRNA称为同功tRNA,它们在细胞内合成量上有多和少的差别,分别称为主要tRNA和次要tRNA。主要tRNA中反密码子识别tRNA中的高频密码子,而次要tRNA中反密码子识别mRNA中的低频密码子。每种氨基酸都只有一种氨基酰tRNA合成酶。因此细胞内有20种氨基酰tRNA合成酶。

tRNA分子中还有一个反密码环,此环上的三个反密码子的作用是与mRNA分子中的密码子靠碱基配对原则而形成氢键,达到相互识别的目的。但在密码子与反密码子结合时具有一定摆动性,即密码子的第3位碱基与反密码子的第1位碱基酸对时并不严格。配对摆动性完全是由tRNA反密码子的空间结构所决定的。反密码的第1位碱基常出现次黄嘌呤I,与A、C、U之间皆可形成氢键而结合,这是最常见的摆动现象。这种摆动现象使得一个tRNA所携带的氨基酸可

排列在23个不同的密码子上,因此当密码子的第3位碱基发生一定程度的突变时,并不影响tRNA带入正确的氨基酸。

在蛋白质生物合成过程中,特异识别mRNA上起始密码子的tRNA被称为起始tRNA,它们参加多肽链合成的起始,其它在多肽链延伸中运载氨基酸的tRNA,统称为延伸tRNA。

二、遗传密码的特征

mRNA分子上以5\\'→3\\'方向,从AUG开始每三个连续的核苷酸组成一个密码子,mRNA中的四种碱基可以组成64种密码子。这些密码不仅代表了20种氨基酸,还决定了翻译过程的起始与终止位置。每种氨基酸至少有一种密码子,最多的有6种密码子。

遗传密码具有以下几种特点:

1、起始密码子与终止密码子(Initiation codon and termination codon) 密码子AUG是起始密码,代表合成肽链的第一个氨基酸的位置,它们位mRNA5′末端,同时它也是蛋氨酸的密码子,因此原核生物和真核生物多肽链合成的第一个氨基酸都是蛋氨酸,当然少数细菌中也用GUG做为起始码。在真核生物CUG偶尔也用作起始蛋氨酸的密码。密码子UAA,UAG,UGA是肽链成的终止密码,不代表任何氨基酸,它们单独或共同存在于mRNA3\\'末端。因此翻译是沿着mRNA分子5′→3′方向进行的。

2、密码的简并性(Degemeracy)

一种氨基酸有几组密码子,或者几组密码子代表一种氨基酸的现象称为密码子的简并性,这种简并性主要是由于密码子的第三个碱基发生摆动现象形成的,也就是说密码子的专一性主要由前两个碱基决定,即使第三个碱基发生突变也能翻译出正确的氨基酸,这对于保证物种的稳定性有一定意义。如:GCU,GCC,GCA,GCG都代表丙氨酸。

3、密码的通用性

大量的事实证明生命世界从低等到高等,都使用一套密码,也就是说遗传密码在很长的进化时期中保持不变。因此这张密码表是生物界通用的。然而,出乎人们预料的是,真核生物线粒体的密码子有许多不同于通用密码,例如人线粒体中,UGA不是终止码,而是色氨酸的密码子,AGA,AGG不是精氨酸的密码子,而是终止密码子,加上通用密码中的UAA和UAG,线粒体中共有四组终止码。

内部甲硫氨酸密码子有两个,即AUG和AUA;而起始甲硫氨酸密码子有四组,即AUN。

第二节肽链的合成

一、核糖体的活性部位

任何生物的核糖体都是由大、小两个亚基组成。1968年已在体外对大肠杆菌小亚基进行了自我装配研究,加入16s rRNA和21种蛋白质,即可形成有天然活性的30s小亚基。通过这些研究使人们能够进一步认识小亚基和大亚基中rRNA与蛋白质的特异功能。核糖体是高度复杂的体系,它的任何个别组分或局部组分都不能起整体的作用,因此必须研究核糖体中蛋白质和RNA的空间结构和位置,才能更完全地了解蛋白质合成的具体过程。 核蛋白体作为蛋白质的合成场所具有以下结构特点和作用:

1、具有mRNA结合位点

位于30s小亚基头部,此处有几种蛋白质构成一个以上的结构域,负责与mRNA的结合,特别是16srRNA3\\'端与mRNA AUG之前的一段序列互补是这种结合必不可少的。

2、具有P位点(peptidyl tRNA site)

又叫做肽酰基tRNA位或P位。它大部分位于小亚基,小部分位于大亚基,它是结合起始 tRNA 并向A位给出氨基酸的位置。

3、具有A位点(AminoacyltRNA site)

又叫做氨基酰tRNA 位或受位。它大部分位于大亚基而小部分位于小亚基,它是结合一个新进入的氨基酰 tRNA 的位置。

5、结合参与蛋白质合成的因子

如起始因子(Initiation Factor,IF)、延长因子(Elengation Factor,EF)和终止因子或释放因子(Release Factor,RF)。

二、肽链的合成过程

1、起始阶段:

起始tRNA:合成的起始密码子是AUG,对应的氨基酸是Met。原核细胞中存在两种携带Met的tRNAfMettRNAmMet,真核细胞tRNAiMettRNAmMet

起始因子:IF

1、IF

2、IF3

过程:IF3+30S亚基

16SrRNA结合SD序列,使P位点正好对准起始密码子AUG。(真核生物识别帽子结构)

在IF2的协助下起始tRNA(甲硫氨酰tRNA)进入P位点。GTP结合,50S亚基结合,GTP水解,改变亚基构象,促进70S核糖体形成,同时释放IF2和IF3。在IF1的作用下,IF2释放,因此IF1是IF2的循环因子。这时,P位点被tRNA占据,而A位点空着。

2、延伸阶段:

EFTu+GTP,+氨酰基tRNA,三元复合物进入A位点(GTP是必须的)。GTP水解,EFTu释放,这时肽基转移酶将甲酰甲硫氨酰基转移到A位,形成第一个肽键。当肽键在A位形成之后,EFG与GTP结合,将A位形成的肽基转移到P位,同时将原来P位的tRNA逐出核糖体。由此可见,延伸因子是交替进入核糖体的。EFTs使EFTu—GDP转变为EFTu+GTP。

3、终止

终止因子:RF1/2/3 经过运输、定位和翻译后处理后才能称为有功能的蛋白质。

三、rRNA在肽链合成中的作用

1、16SrRNA的作用:rRNA 的3端在起始时与mRNA 直接相互作用; 16S rRNA 上的专一区域与A 位点及P 位点上tRNA 反密码子区直接相互作用;与23S rRNA 相互作用。

2、23SrRNA的作用:具有肽基转移酶的活性

第七章 原核生物基因表达调控

教学目的:使学生掌握原核生物基因表达在转录水平和翻译水平的主要方式。

教学重点、难点:操纵子;衰减子;反义RNA;RNA干扰。 课时安排:4学时 教学内容:

第一节转录水平的调控

一、操纵元

操纵元是原核基因表达调控的一种重要的组织形式,大肠杆菌的基因多数以操纵元的形式组成基因表达调控的单元。

操纵元中被调控的编码蛋白质的基因可称为结构基因(structural gene, SG)。一个操纵元中含有2个以上的结构基因,多的可达十几个。每个结构基因是一个连续的开放读框(open reading frame),5\\'端有翻译起始码(DNA存储链上是ATG,转录成mRNA就是AUG),3\\'端有翻译终止码(DNA存储链上是TAA、TGA或TAG,转录成mRNA就是UAA、UGA或UAG)。各结构基因头尾衔接、串连排列,组成结构基因群。至少在第一个结构基因5\\'侧具有核糖体结合位点(ribosome binding site, RBS),因而当这段含多个结构基因的DNA被转录成多顺反子mRNA,就能被核糖体所识别结合、并起始翻译。核糖体沿mRNA移动;在合成完第一个编码的多肽后,核糖体可以不脱离mRNA而继续翻译合成下一个基因编码的多肽,直至合成完这条多顺反子mRNA

二、基因转录的翻译调控-衰减子

色氨酸是构成蛋白质的组分,一般的环境难以给细菌提供足够的色氨酸,细菌要生存繁殖通常需要自己经过许多步骤合成色氨酸,但是一旦环境能够提供色氨酸时,细菌就会充分利用外界的色氨酸、减少或停止合成色氨酸,以减轻自己的负担。细菌所以能做到这点是因为有色氨酸操纵元(trp operon)的调控。

合成色氨酸所需要酶类的基因E、D、C、B、A等头尾相接串连排列组成结构基因群,受其上游的启动子Ptrp和操纵子o的调控,调控基因trpR的位置远离PO结构基因群,在其自身的启动子作用下,以组成性方式低水平表达分子量为47000的调控蛋白R。R并没有与o结合的活性,当环境能提供足够浓度的

色氨酸时,R与色氨酸结合后构象变化而活化,就能够与o特异性亲和结合,阻遏结构基因的转录,因此这是属于一种负性调控的、可阻遏的操纵元(repreible operon),即这操纵元通常是开放转录的,当有效应物(色氨酸为阻遏剂)作用时,则阻遏关闭转录。细菌不少生物合成系统的操纵元都属于这种类型,其调控可使细菌处在生存繁殖最经济最节省的状态。

实验观察表明:当色氨酸达到一定浓度,但还没有高到能够活化R使其起阻遏作用的程度时,产生色氨酸合成酶类的量已经明显降低,而且产生的酶量与色氨酸浓度呈负相关。仔细研究发现这种调控现象与色氨酸操纵元特殊的结构有关。

在色氨酸操纵元PtrpO与第一个结构基因trpE之间有162bp的一段先导序列(leadingsequence, L)。实验证明当色氨酸达一定浓度时,RNA聚合酶的转录会终止在这里。这段序列中含有编码由14个氨基酸组成的短肽的开放读框,其序列中有2个色氨酸相连,在此开放读框前有核糖体识别结合位点(RBS)序列,提示这段短开放读框在转录后是能被翻译的。在先导序列的后半段含有3对反向重复序列(见图),在被转录生成mRNA时都能够形成发夹式结构,但由于B的序列分别与A和C重叠,所以如果B形成发夹结构,A和C都不能再形成发夹结构;相反,当A形成发夹结构时,B就不能形成发夹结构,却有利于C生成发夹结构。C后面紧跟一串A(转录成RNA就是一串U),C实际上是一个终止子,如果转录mRNA时它形成发夹结构,就能使RNA聚合酶停止转录而从mRNA上脱离下来

在色氨酸未达到能起阻遏作用的浓度时,从Ptrp起始转录,RNA聚合酶沿DNA转录合成mRNA,同时核糖体就结合到新生成的mRNA核糖体结合位点上开始翻译。当色氨酸浓度低时,生成的tRNAtrp色氨酸量就少,能扩散到核糖体mRNA形成的翻译复合体中供给合成短肽的几率低,使核糖体沿mRNA翻译移动的速度慢,赶不上RNA聚合酶沿DNA移动转录的速度,这时核糖体占据短开放读框的机会较多,使A不能生成发夹结构,于是B就形成发夹结构,阻止了C生成终止信号的结构,RNA聚合酶得以沿DNA前进,继续去转录其后trpE等基因,trp操纵元就处于开放状态。当色氨酸浓度增高时,tRNAtrp色氨酸浓度随之升高,核糖体沿mRNA翻译移动的速度加快,占据到B段的机会增加,B生

成发夹结构的机会减少,C形成终止结构的机会增多,RNA聚合酶终止转录的的几率增加,于是转录减弱。如果当其他氨基酸短缺(注意:短开放读框编码的14肽中多数氨基酸能由环境充分供应的机会是不多的)或所有的氨基酸都不足时,核糖体翻译移动的速度就更慢,甚至不能占据A的序列,结果有利于A和C发夹结构的形成,于是RNA聚合酶停止转录,等于告诉细菌:“整个氨基酸都不足,即使合成色氨酸也不能合成蛋白质,不如不合成以节省能量 ”。

由此可见,先导序列起到随色氨酸浓度升高降低转录的作用,这段序列就称为衰减子attenuator)。在trp操纵元中,对结构基因的转录阻遏蛋白的负调控起到粗调的作用,而衰减子起到细调的作用。细菌其他氨基酸合成系统的许多操纵元(如组氨酸、苏氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸等操纵元)中也有类似的衰减子存在。

第二节 翻译水平的调控

一、

反义RNA的调控作用

反义RNA通过与特定的mRNA结合,结合位点通常是mRNA上的SD序列及N端的密码子,从而抑制mRNA的翻译。

二、

mRNA自身的二级结构影响翻译过程

终止子、衰减子和反义RNA 都是mRNA通过二级结构的改变在不同水平上对基因表达进行调控。除此之外,mRNA自身的二级结构还能影响核糖体的结合以及mRNA的寿命从而影响翻译。

三、

四、

蛋白质合成的自体调控 严谨反应

细菌处于极差的生长条件下,由于缺乏足够的氨基酸,蛋白质合成受到抑制,因而会关闭大量的代谢过程,这就是应急反应(Stringent response) 或应急调控。

第八章 真核生物基因表达调控

教学目的:让学生理解真核生物基因表达调控的复杂性,并掌握在各水平上的调控机制。

教学重点、难点:染色质结构对基因转录的影响;转录水平的调控。 课时安排:4学时 教学内容:

尽管我们现在对真核基因表达调控知道还不多,但与原核生物比较它具有一些明显的特点。

第一节真核生物基因调控的特点

一、真核基因表达调控的环节更多

如前所述,基因表达是基因经过转录、翻译、产生有生物活性的蛋白质的整个过程。同原核生物一样,转录依然是真核生物基因表达调控的主要环节。但真核基因转录发生在细胞核(线粒体基因的转录在线粒体内),翻译则多在胞浆,两个过程是分开的,因此其调控增加了更多的环节和复杂性,转录后的调控占有了更多的分量。

真核细胞在分化过程中会发生基因重排(gene rearrangement),即胚原性基因组中某些基因会再组合变化形成第二级基因。例如编码完整抗体蛋白的基因是在淋巴细胞分化发育过程中,由原来分开的几百个不同的可变区基因经选择、组合、变化,与恒定区基因一起构成稳定的、为特定的完整抗体蛋白编码的可表达的基因。这种基因重排使细胞可能利用几百个抗体基因的片段,组合变化而产生能编码达108种不同抗体的基因,其中就有复杂的基因表达调控机理。

此外,真核细胞中还会发生基因扩增(gene amplification),即基因组中的特定段落在某些情况下会复制产生许多拷贝。最早发现的是蛙的成熟卵细胞在受精后的发育过程中其rRNA基因(可称为rDNA)可扩增2000倍,以后发现其他动物的卵细胞也有同样的情况,这很显然适合了受精后迅速发育分裂要合成大量蛋白质,需要有大量核糖体。又如MTX(methotrexate)是叶酸的结构类似物,一些哺乳类细胞会对含有利用叶酸所必需的二氢叶酸还原酶(dihydrofolate reductase, DHFR)基因的DNA区段扩增40100倍,使DHFR的表达量显著增加,从而提高对MTX的抗性。基因的扩增无疑能够大幅度提高基因表达产物的量,但这种调控机理至今还不清楚。

真核基因组DNA绝大部分都在细胞核内与组蛋白等结合成染色质,染色质的结构、染色质中NA

1、染色质结构影响基因转录

细胞分裂时染色体的大部分到间期时松开分散在核内,称为常染色质(euchromatin),松散的染色质中的基因可以转录。染色体中的某些区段到分裂期后不像其他部分解旋松开,仍保持紧凑折叠的结构,在间期核中可以看到其浓集的斑块,称为异染色质(heterochromatin),其中从未见有基因转录表达;原本在常染色质中表达的基因如移到异染色质内也会停止表达;哺乳类雌体细胞2条X染色体,到间期一条变成异染色质者,这条X染色体上的基因就全部失活。可

2、组蛋白的作用

早期体外实验观察到组蛋白与DNA结合阻止DNA上基因的转录,去除组蛋基因又能够转录。组蛋白是碱性蛋白质,带正电荷,可与DNA链上带负电荷的磷酸基相结合,从而遮蔽了DNA分子,妨碍了转录,可能扮演了非特异性阻遏蛋白的作用;染色质中的非组蛋白成分具有组织细胞特异性,可能消除组蛋白

发现核小体后,进一步观察核小体结构与基因转录的关系,发现活跃转录的染色质区段,有富含赖氨酸的组蛋白(H1组蛋白)水平降低,H2A·H2B组蛋白二聚体不稳定性增加、组蛋白乙酰化(acetylation)和泛素化(ubiquitination),以及H3组蛋白巯基化等现象,这些都是核小体不稳定或解体的因素或指征。转录活跃的

3、转录活跃区域对核酸酶作用敏感度增加

染色质DNA受DNase Ⅰ作用通常会被降解成100、400„„bp的片段,反映了完整的核小体规则的重复结构。但活跃进行转录的染色质区域受DNase Ⅰ消化常出现100-200bp的DNA片段,且长短不均一,说明其DNA受组蛋白掩盖的结构有变化,出现了对DNase Ⅰ高敏感点(hypersensitive site)。这种高敏感点常出现在转录基因的5′侧区(5′ flanking region)、3′末端或在基因上,多在调控蛋白结合位点的附近,分析该区域核小体的结构发生变化,可能有利于调控

蛋白

4、DNA拓扑结构变化

天然双链DNA的构象大多是负性超螺旋。当基因活跃转录时,RNA聚合酶转录方向前方DNA的构象是正性超螺旋,其后面的DNA为负性超螺旋。正性超螺旋会拆散核小体,有利于RNA聚合酶向前移动转录;而负性超螺旋则有利于核

5、DNA碱基修饰变化

真核DNA中的胞嘧啶约有5%被甲基化为5甲基胞嘧啶(5methylcytidine,m5C),而活跃转录的DNA段落中胞嘧啶甲基化程度常较低。这种甲基化最常发生在某些基因5\\'侧区的CpG序列中,实验表明这段序列甲基化可使其后的基因不能转录,甲基化可能阻碍转录因子与DNA特定部位的结合从而影响转录。如果用基因打靶的方法除去主要的DNA甲基化酶,小鼠的胚胎就不能正常发育而死亡,可见DNA

由此可见,染色质中的基因转录前先要有一个被激活的过程,但目前对激活机制还缺乏认识。

真核RNA聚合酶对启动子的亲和力很低,基本上不依靠自身来起始转录,需要依赖多种激活蛋白的协同作用。真核基因调控中虽然也发现有负性调控元件,但其存在并不普遍;真核基因转录表达的调控蛋白也有起阻遏和激活作用或兼有两种作用者,但总的是以激活蛋白的作用为主。即多数真核基因在没有调控蛋白作用时是不转录的,需要表达时就要有激活的蛋白质来促进转录。换言之:真核基因表达以正性调控为主导。

第二节 真核基因转录水平的调控

真核细胞的三种RNA聚合酶(Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ)中,只有RNA聚合酶Ⅱ能转录生成mRNA,以下主要讨论RNA聚合酶Ⅱ的转录调控。

一、顺式作用元件(cis-acting elements)

真核基因的顺式调控元件是基因周围能与特异转录因子结合而影响转录的DNA序列。其中主要是起正性调控作用的顺式作用元件,包括启动子(promoter)、增强子(enhancer);近年又发现起负性调控作用的元件如沉默子(silencer)

1、启动子

与原核启动子的含义相同,是指RNA聚合酶结合并起动转录的DNA序列。但真核同启动子间不像原核那样有明显共同一致的序列,而且单靠RNA聚合酶难以结合DNA而起动转录,而是需要多种蛋白质因子的相互协调作用,不同蛋白质因子又能与不同DNA序列相互作用,不同基因转录起始及其调控所需的蛋白因子也不完全相同,因而不同启动子序列也很不相同,要比原核更复杂、序列也更长。真核启动子一般包括转录起始点及其上游约100-200bp序列,包含有若干具有独立功能的DNA序列元件,每个元件约长7-30bp。

启动子中的元件可以分为两种:核心启动子元件(core promoter element)和上游启动子元件(upstream promoter element) (见第五章)。

2、增强子

增强子是一种能够提高转录效率的顺式调控元件,最早是在SV40病毒中发现的长约200bp的一段DNA,可使旁侧的基因转录提高100倍,其后在多种真核生物,甚至在原核生物中都发现了增强子。增强子通常占100-200bp长度,也和启动子一样由若干组件构成,基本核心组件常为8-12bp,可以单拷贝或多拷贝串连形式存在。增强子的作用有以下特点:

1)增强子提高同一条DNA链上基因转录效率,可以远距离作用,通常可距离1-4kb、个别情况下离开所调控的基因30kb仍能发挥作用,而且在基因的上游或下游都能起作用。

2)增强子作用与其序列的正反方向无关,将增强子方向倒置依然能起作用。

3)增强子要有启动子才能发挥作用,没有启动子存在,增强子不能表现活性。但增强子对动子没有严格的专一性,同一增强子可以影响不同类型启动子的转录。例如当含有增强子的病毒基因组整合入宿主细胞基因组时,能够增强整合区附近宿主某些基因的转录;当增强子随某些染色体段落移位时,也能提高移到的新位置周围基因的转录。使某些癌基因转录表达增强,可能是肿瘤发生的因素

4)增强子的作用机理虽然还不明确,但与其他顺式调控元件一样,必须与特定的蛋白质因结合后才能发挥增强转录的作用。增强子一般具有组织或细胞特

异性,许多增强子只在某些细胞或组织中表现活性,是由这些细胞或组织中具有

3、沉默子

最早在酵母中发现,以后在T淋巴细胞的T抗原受体基因的转录和重排中证实这种负调控顺式元件的存在。目前对这种在基因转录降低或关闭中起作用的序列研究还不多,但从已有的例子看到:沉寂子的作用可不受序列方向的影响,也能远距离发挥作用,并可对异源基因的表达起作用。

二、反式作用因子

以反式作用影响转录的因子可统称为转录因子(transcription factors, TF)。RNA聚合酶是一种反式作用于转录的蛋白因子。在真核细胞中RNA聚合酶通常不能单独发挥转录作用,而需要与其他转录因子共同协作。与RNA聚合酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ相应的转录因子分别称为TFⅠ、TFⅡ、TFⅢ,对TFⅡ研究最多。

以前认为与TATA盒结合的蛋白因子是TFⅡ-D,后来发现TFⅡ-D实际包括两类成分:与TATA盒结合的蛋白是TBP(TATAbox binding protein),是唯一能识别TATA盒并与其结合的转录因子,是三种RNA聚合酶转录时都需要的;其他称为TBP相关因子(TBP

aociated factors TAF),至少包括8种能与TBP紧密结合的因子。转录前先是TFⅡ-D与TATA盒结合;继而TFⅡ-B以其C端与TBP-DNA复合体结合,其N端则能与RNA聚合酶Ⅱ亲和结合,接着由两个亚基组成的TFⅡ-F加入装配,TFⅡ-F能与RNA聚合酶形成复合体,还具有依赖于ATP供给能量的DNA解旋酶活性,能解开前方的DNA双螺旋,在转录链延伸中起作用。这样,启动子序列就与TFⅡ-D、B、F及RNA聚合酶Ⅱ结合形成一个“最低限度”能有转录功能基础的转录前起始复合物(preintitiation complex, PIC),能转录mRNA。TFⅡ-H是多亚基蛋白复合体,具有依赖于ATP供给能量的DNA解旋酶活性,在转录链延伸中发挥作用;TFⅡ-E是两个亚基组成的四聚体,不直接与DNA结合而可能是与TFⅡ-B联系,能提高ATP酶的活性;TFⅡ-E和TFⅡ-H的加入就形成完整的转录复合体,能转录延伸生成长链RNA,TFⅡ-A能稳定TFⅡ-D与TATA盒的结合,提高转录效率,但不是转录复合体一定需要的。

以上所述是典型的启动子上转录复合体的形成,但有的真核启动子不含

TATA盒或不通过TATA盒开始转录。例如有的无TATA盒的启动子是靠TFⅡ-I和TFⅡ-D共同组成稳定的转录起始复合体开始转录的。由此可以看到真核转录起始的复杂性。

不同基因由不同的上游启动子元件组成,能与不同的转录因子结合,这些转录因子通过与基础的转录复合体作用而影响转录的效率。现在已经发现有许多不同的转录因子,看到的现象是:同一DNA序列可被不同的蛋白因子所识别;能直接结合DNA序列的蛋白因子是少数,但不同的蛋白因子间可以相互作用,因而多数转录因子是通过蛋白质-蛋白质间作用与DNA序列联系并影响转录效率的。转录因子之间或转录因子与DNA的结合都会引起构象的变化,从而影响转录的效率。

作为蛋白质的转录因子从功能上分析其结构可包含有不同区域:1)DNA结合域(DNA binding domain),多由60-100个氨基酸残基组织的几个亚区组成;2)转录激活域(activating domain),常由30-100氨基酸残基组成,这结构域有富含酸性氨基酸、富含谷氨酰胺、富含脯氨酸等不同种类,以酸性结构域最多见;3)连接区,即连接上两个结构域的部分。不与DNA直接结合的转录因子没有DNA结合域,但能通过转录激活域直接或间接作用于转录复合体而影响转录效率。

与DNA结合的转录因子大多以二聚体形式起作用,与DNA结合的功能域常见有以下几种:

1、螺旋转角螺旋(helixturnhelix, HTH)及螺旋环螺旋(helixloophelix,HLH)

这类结构至少有两个α螺旋,其间由短肽段形成的转角或环连接,两个这样的motif结构以二聚体形式相连,距离正好相当于DNA一个螺距(3.4nm),两个α螺旋刚好分别嵌入DNA的深沟。

2、锌指(zinc finger)

每个重复的“指”状结构约含23个氨基酸残基,锌以4个配价键与4个半胱氨酸、或2个半胱氨酸和2个组氨酸相结合。整个蛋白质分子可有20个这样的锌指重复单位。每一个单位可以其指部伸入DNA双螺旋的深沟,接触5个核苷酸。例如与GC盒结合的转录因子SP1中就有连续的3个锌指重复结构。)碱性-亮氨酸拉链(basic leucine zipper, bZIP),该结构的特点是蛋白质分子的肽链上每隔6个氨基酸就有一个亮氨酸残基,结果就导致这些亮氨酸残基都在α螺旋的同一个方向出现。两个相同结构的两排亮氨酸残基就能以

疏水键结合成二聚体,该二聚体的另一端的肽段富含碱性氨基酸残基,借其正电荷与DNA双螺旋链上带负电荷的磷酸基团结合。若不形成二聚体则对DNA的亲和结合力明显降低。在肝脏、小肠上皮、脂肪细胞和某些脑细胞中有称为C/EBP家族的一大类蛋白质能够与CAAT盒和病毒增强子结合,其特征就是能形成bZIP二聚体结构(如右图)。

从上述可见:转录调控的实质在于蛋白质与DNA、蛋白质与蛋白质之间的相互作用,构象的变化正是蛋白质和核酸“活”的表现。但对生物大分子间的辨认、相互作用、结构上的变化及其在生命活动中的意义,人们的认识和研究还只在起步阶段,其中许多内容甚至重要的规律我们可能至今还一无所知,有待于努力探索。

第三节 转录后水平的调控

一、hnRNA的选择性加工运输

二、mRNA前体的选择性拼接

第三节翻译水平的调控

一、mRNA的稳定性

二、

三、

mRNA翻译起始的调控

真核生物蛋白质合成的自体调控

核酸的结构与功能

教学要求:

1.掌握核苷酸的分子结构,了解连接键及分子表达式 2.重点掌握DNA、RNA的结构特征及主要功能 3.了解DNA的理化性质与结构的关系 4.了解DNA的高级结构

课时安排:总学时 4.0

第一节

核酸的化学组成及一级结构

1.0 第二节

DNA的空间结构与功能

1.0 第三节

RNA的结构和功能

1.0 第四节

核酸的理化性质

0.8 第五节

核酸酶

0.2

重点:

1. 核酸的化学组成 2. DNA的双螺旋结构 3. RNA的结构和功能 4. 核酸的理化性质

难点:

1. DNA的双螺旋结构 2. 核酸的理化性质

教学内容:

一、核酸的化学组成及一级结构

1.核苷酸

嘌呤与嘧啶,DNA和RNA分子中核苷酸组成上的特点,核苷酸各组分之间的连接方式 2.脱氧核苷酸的连接 3.核苷酸的连接 4.核酸的一级结构

二、DNA的空间结构与功能

1.DNA的双螺旋结构

Chargaff规则、B双螺旋结构模型和ZDNA。 2.DNA的超螺旋结构

染色质、核小体、组蛋白、基因 3.DNA是遗传信息的物质基础

三、RNA的结构和功能

1.mRNA 模板、hnRNA 2.tRNA

稀有碱基、茎环结构、反密码环 3.rRNA

核糖体、多核糖体

四、核酸的理化性质

紫外吸收、变性、复性、增色效应、减色效应、解链温度、杂交、探针。

五、核酸酶

思考题:

1. 核酸紫外测定的分子基础是什么?

2. DNA和RNA的紫外测定结果有何不同?为什么? 3. DNA的双螺旋结构的要点是什么?

核苷酸代谢

教学要求:

1.了解食物核酸的消化吸收和体内核苷酸合成的途径。

2.掌握嘌呤和嘧啶核苷酸的合成原料,合成反应特点,分解代谢的产物。

3.掌握核糖单核苷酸向脱氧核糖核苷酸的转变。

4.了解核苷酸类抗代谢作用的生化环节。

课时安排:总学时 4.0 第一节

嘌呤核苷酸的合成与分解代谢

2.0 第二节

嘧啶核苷酸的合成与分解代谢

2.0 重点:

1.嘌呤和嘧啶核苷酸的合成原料 2.嘌呤和嘧啶核苷酸分解代谢的产物

3.脱氧核糖核苷酸的生成 难点:

嘌呤和嘧啶核苷酸的合成过程 教学内容:

一、嘌呤核苷酸的合成与分解代谢

1.嘌呤核苷酸的从头合成

IMP的合成原料及关键酶,AMP和GMP的转变,嘌呤核苷酸合成的调节,嘌呤核苷酸的的补救合成和相互转变,脱氧核苷酸的生成,嘌吟核苷酸的抗代谢物。

2.嘌呤核苷酸的分解代谢

磷酸核苷、核苷及嘌呤的降解,尿酸的生成。

二、嘧啶核苷酸的合成与分解代谢

1.嘧啶核苷酸的从头合成

UMP的合成原料及关键酶,UMP向CTP和TMP的转变,嘧啶核苷酸补救合成,嘧啶核苷酸的抗代谢物。 2.嘧啶核苷酸的分解代谢

α氨基异丁酸的排泄。

思考题:

1. 核苷酸抗代谢物分几类?试分析其抗肿瘤作用的分子基础。 2. 试小结嘌呤环和嘧啶环中个原子的分子来源。

DNA的生物合成

教学要求:

1.熟悉遗传信息流向的中心法则。

2.掌握DNA复制方式、逆转录作用及相关酶系的特征。

3.了解DNA修复系统及特点。

课时安排:总学时 4.0 第一节

复制的基本规律

0.5 第二节

DNA复制的酶学和拓扑学变化

1.0 第三节

DNA生物合成过程

1.

5第四节

逆转录和其他复制方式

0.5 第五节

DNA损伤(突变)与修复

0.5

重点: 1.遗传信息流向的中心法则。

2.原核生物DNA半保留复制方式及相关酶系。 难点:

1. 真核生物的DNA生物合成 2. 端粒和端粒酶 教学内容:

一、复制的基本规律

1.半保留复制的实验依据及意义

2.双向复制

3.半不连续复制

二、DNA复制的酶学和拓扑学变化

1.复制的化学反应

2.DNA聚合酶

原核生物与真核生物的DNA聚合酶

3.复制高保真性的酶学依据

4.复制中的解链伴有DNA分子拓扑学变化

解螺旋酶、拓扑酶、SSB。

引物酶和引发体。

5.DNA连接酶连接DNA双链中的单链缺口

三、DNA生物合成过程

1.原核生物的DNA生物合成

复制的起始:DNA解成单链,引发体的形成;复制的延长:复制延长的生化过程,复制的半不连续性及冈崎片段;复制的终止:切除引物、填补空缺和连接切口。

2.真核生物的DNA生物合成

复制的起始与原核基本相似;复制的延长发生DNA聚合酶α/δ转换;复制的终止:端粒和端粒酶。

四、逆转录和其他复制方式

1.逆转录病毒的基因组是RNA,其复制方式是逆转录 2.逆转录的发现发展了中心法则 3.滚环复制和D环复制

五、DNA损伤(突变)与修复

1.突变的意义。

2.引发突变的因素。

3.突变分子改变的类型

错配,缺失、插入和框移突变,重排。

4.DNA损伤的修复:光修复、切除修复、重组修复、SOS修复。 思考题:

1.试简述DNA复制的特征和参与DNA复制的酶系。

2.什么是逆转录?试简述逆转录的基本过程。

3.试简述DNA突变的类型及DNA损伤的修复类型。

RNA的生物合成

教学要求:

1.掌握转录是RNA生物合成及信息流动的重要环节。

2.掌握转录的特点及三类RNA转录后的加工。

3.了解转录酶的特征。

4.熟悉核酶及其功能。

课时安排:总学时 4.0 第一节

原核生物转录的模板和酶

1.0 第二节

原核生物的转录过程

1.0 第三节

真核生物RNA的生物合成

1.0

第四节

真核生物RNA的加工

1.0 重点:

1. 原核生物转录的模板和酶 2. 原核生物的转录过程 3. 真核生物RNA的加工

难点:

真核生物mRNA的加工中内含子的剪接方式、mRNA编辑。

教学内容:

一、原核生物转录的模板和酶

1.原核生物转录的模板

2.RNA聚合酶

全酶、核心酶

3.RNA聚合酶结合到DNA的启动子上启动转录

二、原核生物的转录过程

1.转录起始

转录起始复合物,开放转录复合体。

2.原核生物转录延长时蛋白质的翻译也同时进行。

3.转录终止

依赖ρ因子、非依赖ρ因子两大类。

三、真核生物RNA的生物合成

1.真核生物有三种DNA依赖性RNA聚合酶

2.转录起始需要启动子、RNA聚合酶和转录因子的参与 3.真核生物转录延长过程中没有转录与翻译同步的现象 4.真核生物转录终止和加尾修饰同时进行

四、真核生物RNA的加工

1.真核生物mRNA的加工

首尾修饰及剪接、内含子的其它剪接方式及功能、断裂基因、mRNA编辑。

2.真核前体rRNA的加工

3.真核生物前体tRNA的加工包括把核苷酸的碱基修饰为稀有碱基。

思考题:

1. 试比较原核生物与真核生物RNA聚合酶有何区郑州军海脑病医院看癫痫病看的怎么样别? 2. 试举例说明什么是mRNA编辑? 3. 试小结真核生物mRNA的加工过程。

蛋白质的生物合成

教学要求:

1.掌握遗传信息、遗传密码与mRNA的关系,遗传密码的特征。

2.掌握蛋白质生物合成体系中主要RNA、三种酶和多种蛋白质因子的功能和作用特点,生物合成过程及能量变化。

3.了解翻译后蛋白质的加工方式。

4.了解蛋白质合成的干扰和抑制。

课时安排:总学时 4.0 第一节

蛋白质生物合成体系

1.0 第二节

氨基酸的活化

1.0 第三节

蛋白质的生物合成过程

1.0

第四节

蛋白质翻译后修饰和靶向运输

0.6 第五节

蛋白质生物合成的干扰和抑制

0.4

重点: 1.遗传密码与mRNA的关系及其特征

2.蛋白质生物合成体系 3.氨基酸的活化

难点: 蛋白质的生物合成过程 教学内容:

一、蛋白质生物合成体系

1.mRNA是蛋白质生物合成的直接模板

遗传密码的方向性、连续性、简并性、通用性和摆动性。

2.核糖体是蛋白质生物合成的场所。

3.tRNA是氨基酸的运载工具及蛋白质生物合成的适配器

氨基酸臂、反密码子

4.蛋白质生物合成需要酶类、蛋白质因子等

二、氨基酸的活化

1.氨基酰tRNA 氨基酰tRNA合成酶

2.真核生物起始氨基酰tRNA是Met tRNAiMet

三、蛋白质的生物合成过程

1.原核生物的肽链合成过程

起始:起始因子;延长:延长因子,注册、成肽、转位,核糖体循环;终止:终止密码子。 2.真核生物的肽链合成过程

四、蛋白质翻译后修饰和靶向运输

1.多肽链折叠为天然构象的蛋白质

分子伴侣、蛋白质二硫键异构酶、肽脯氨酸顺反异构酶。

2.蛋白质一级结构修饰主要是肽键水解和化学修饰

3.蛋白质空间结构修饰包括亚基聚合和辅基连接 4.合成后蛋白质可被靶向输送至细胞特定部位

五、蛋白质生物合成的干扰和抑制 1.抗生素对翻译的抑制作用

2.其他干扰蛋白质生物合成的物质

思考题:

1.试简述蛋白质生物合成体系及3种RNA在蛋白质生物合成中的作用。 2.试小结原核生物复制、转录和翻译的基本过程。

基因表达调控

教学要求:1.掌握原核生物转录水平的调控方式和机理。

2.熟悉基因表达调控基本概念与原理。 3.了解真核生物的基因转录调控方式。

课时安排:总学时 4.0 第一节

基因表达调控的基本概念

1.0 第二节

基因表达调控的基本原理

1.0 第三节

原核基因表达调节

1.

5第四节

真核基因表达调节

0.5 重点: 原核生物转录水平的调控方式

乳糖操纵子调控模式

难点: 真核生物的基因转录调控方式 教学内容:

一、基因表达调控的基本概念

1.基因表达是指基因转录及翻译的过程

2.基因表达具有时间特异性和空间特异性

3.基因表达的方式及调节存在很大的差异

组成性表达、诱导和阻遏表达。

4.基因表达调控为生物体学生长、发育所必需

适应环境、维持生长和增殖、维持个体发育与分化。

二、基因表达调控的基本原理

1.基因表达调控呈现多层次和复杂性

2.基因转录激活受到转录调节蛋白与启动子相互作用的调节

三、原核基因表达调节

1.原核基因转录调节特点

σ因子决定RNA聚合酶识别特异性、操纵子调控模型和阻遏蛋白与阻遏机制的普遍性。

2.操纵子调控模式在原核基因转录起始调节中具有普遍性

乳糖操纵子结构、阻遏蛋白的负调节、cAMPCAP的正调节、协调调节。 3.原核生物具有不同的转录终止调节机制

4.原核生物在翻译水平同样受到多个环节的调节

四、真核基因表达调节

1.真核基因组具有独特的结构特点

2.真核基因表达调控更为复杂

3.RNA PolI和PolIII转录体系的调节相对简单

4.RNA PolII转录起始的调节非常复杂

顺式作用元件、反式作用因子、mRNA转录激活及其调节。

5.RNA PolII转录终止的调节机制尚不清楚

6.转录后水平的调节也是基因表达调控的重要环节

7.基因表达在翻译水平以及翻译后阶段仍然可以受到调节

思考题:

1.原核生物基因表达调控的基本原理是什么? 2.乳糖操纵子是如何实现基因表达调控的?

3.顺式作用元件、反式作用因子在真核基因表达调节中的作用是什么?

基因重组与基因工程

教学要求:

1.掌握自然界的基因转移和重组。

2.熟悉重组DNA技术的相关概念。

3.掌握重组DNA技术的基本原理。

4.了解重组DNA技术与医学的关系。

课时安排:总学时 4.0 第一节

自然界DNA重组和基因转移是经常发生的

1.5 第二节

重组DNA技术

2.0 第三节

重组DNA技术与医学的关系

0.5

重点:

1. 自然界的基因转移和重组

2. 重组DNA技术的基本原理及步骤

难点:

重组DNA技术的基本原理

教学内容:

一、自然界DNA重组和基因转移是经常发生的

1.同源重组

2.细菌的基因转移与重组

3.特异位点重组

4.转座重组。

二、重组DNA技术

1.重组DNA技术相关概念

DNA克隆,工具酶,基因载体。

2.重组DNA技术基本原理及操作步骤

目前基因的获取、克隆载体的选择和构建、外源基因与载体的连接、重组DNA导入受体菌、重组体筛选、克隆基因的表达。

三、重组DNA技术与医学的关系

1.疾病基因的发现 2.生物制药

3.基因诊断与治疗 4.遗传病的预防

思考题:

1. 简述基因工程的基本条件和基本过程。

2. 举例说明基因工程在工业、农业和医学中的应用。

细胞信息转导

教学要求:

1.掌握细胞间的信号转导的概念。

2.掌握各种受体的分子结构及其信号转导通路。

3.了解信息传递途径的交互联系。

4.了解细胞信号转导与医学的关系。

课时安排:总学时 4.0 第一节

细胞信息转导概述

1.0 第二节

细胞内信号转导相关分子

1.0 第三节

各种受体介导的细胞内基本信号转导通路

1.

5第四节

细胞信号转导与医学

0.5 重点:

1. 细胞间的信号转导的概念

2. 各种受体的分子结构及其信号转导通路

难点:

1. 各种受体介导的细胞内基本信号转导通路 2. G蛋白的结构

教学内容:

一、细胞信息转导概述

1.细胞外化学信号有可溶性和膜结合型两种形式 2.细胞经由特异性受体接受细胞外信号

3.细胞内信号分子结构、含量和分布变化是信号转导网络工作的基础

二、细胞内信号转导相关分子

1.第二信使的浓度和分布变化是重要的信号转导方式

2.蛋白质作为细胞内信号转导分子

三、各种受体介导的细胞内基本信号转导通路

1.细胞内受体多属于转录因子

2.离子通道型膜受体是化学信号与电信号转换器 3.七跨膜受体依赖G蛋白转导信号

4.单跨膜受体依赖酶的催化作用传递信号 5.细胞信号转导过程的特点和规律

四、细胞信号转导与医学

1.信号转导分子的结构改变是许多疾病发生发展的基础 2.细胞信号转导分子是重要的药物作用靶位

思考题:

1.按照作用方式的不同,细胞内信号分子有哪些?各有何特点? 2.试述信号分子与受体结合的特点。

3.各类型的膜受体结构和功能上有什么特点?

4.简述G蛋白的结构,并说明其活化型和非活化型如何互变。

糖蛋白、蛋白聚糖和细胞外基质

教学要求:

1.掌握糖蛋白、蛋白聚糖和细胞外基质的概念及糖蛋白的分类。 2.熟悉胶原蛋白的结构与功能。 3.熟悉糖蛋白寡糖链的功能。

4.了解纤连蛋白和层粘连蛋白的结构与功能。

课时安排:总学时 4.0 第一节

糖蛋白

2.0 第二节

蛋白聚糖

1.0 第三节

细胞外基质

1.0

重点: 糖蛋白、蛋白聚糖和细胞外基质的概念

糖蛋白的分类 难点:糖蛋白分子中聚糖的功能 教学内容:

一、糖蛋白

1.糖蛋白的结构

N连接糖蛋白:高甘露糖型、复杂型、杂合性;O连接糖蛋白。

2.糖蛋白分子中聚糖的功能

二、蛋白聚糖

1.重要的糖胺聚糖。

2.核心蛋白。

3.蛋白聚糖的生物合成。

4.蛋白聚糖的功能。

三、细胞外基质

1.胶原。

2.纤连蛋白。

3.层粘连蛋白。

思考题:

1. 试简述糖蛋白N连接聚糖的分类及其结构特点。 2. 试简要说明糖蛋白分子中聚糖的功能。

癌基因、抑癌基因与生长因子

教学要求:

1.掌握癌基因、抑癌基因及生长因子的基本概念。 2.熟悉原癌基因产物及其功能。

3.了解癌基因活化机制及抑癌基因作用机制。

课时安排:总学时 4.0 第一节

癌基因

2.0 第二节

抑癌基因

1.0 第三节

生长因子

1.0

重点:

1. 癌基因、抑癌基因及生长因子的基本概念 2. 原癌基因产物及其功能

难点:

癌基因活化机制及抑癌基因作用机制

教学内容:

一、癌基因

1.病毒癌基因

DNA病毒、RNA病毒

2.细胞癌基因

src家族、ras家族、myc家族、sis家族、myb家族。

3.癌基因活化的机制

获得启动子、染色体易位、原癌基因扩增、点突变。

4.原癌基因的产物与功能

生长因子、跨膜生长因子受体、细胞内信号传导体、核内转录因子。

二、抑癌基因

1.抑癌基因的基本概念

2.常见的抑癌基因

3.抑癌基因的作用机制

三、生长因子

1.概述

2.生长因子的作用机制

3.生长因子与疾病

细胞凋亡、心血管疾病

思考题:

1. 什么是病毒癌基因?什么是细胞癌基因?两者有何区别? 2. 什么是生长因子?是举例说明其作用机制。

常用分子生物学技术的原理及应用

教学要求:

1.掌握分子杂交、印迹技术及PCR原理。

2.熟悉印迹技术的类别及应用,PCR基本过程。 3.了解核酸序列分析。

4.熟悉基因诊断的概念,常用技术方法及其应用。 5.了解基因治疗的概念及其应用。

课时安排:总学时 6.0 第一节

分子杂交与印迹技术

1.0 第二节

PCR技术的原理及应用

1.0 第三节

核酸序列分析

0.4 第四节

基因文库

0.4 第五节

生物芯片技术

0.4 第六节

生物大分子相互作用研究技术

1.0 第七节

遗传修饰动物模型的建立与应用

0.4 第八节

疾病相关基因的克隆与鉴定

0.4 第九节

基因诊断和基因治疗

1.0 重点:

1.分子杂交、印迹技术的分类及应用。 2.PCR原理及PCR基本过程。

3.基因诊断的概念,常用技术方法及其应用。

难点:

1. 核酸序列分析

2. 疾病相关基因的克隆与鉴定

教学内容:

一、分子杂交与印迹技术

1.分子杂交和印迹技术的原理

印迹技术、探针技术

2.印迹技术的类别及应用

DNA印迹、RNA印迹、蛋白质的印迹分析

二、PCR技术的原理及应用

1.PCR技术的工作原理。

2.PCR技术的的主要用途。

3.几种重要的PCR衍生技术

逆转录PCR、原位PCR、实时PCR、

三、核酸序列分析

1.DNA链末端终止法化学裂解法

2.DNA自动测序

四、基因文库

1.基因组DNA文库 2.c DNA文库

五、生物芯片技术 1.基因芯片 2.蛋白质芯片

六、生物大分子相互作用研究技术 1.蛋白质相互作用研究技术

2.DNA蛋白质相互作用分子分析技术

七、遗传修饰动物模型的建立与应用 1.转基因技术 2.核转移技术 3.基因剔除技术

4.基因转移和基因剔除技术在医学发展中的作用

八、疾病相关基因的克隆与鉴定 1.功能克隆 2.定位克隆

九、基因诊断和基因治疗

1.基因诊断

DNA序列分析、PCR技术、基因芯片。 2.基因治疗

基因治的基本策略、基因治疗的基本程序

思考题:

1.印迹技术有哪几类?试比较他们在原理及操作过程中的不同点。 2.PCR的原理是什么?试小结其基本过程。 3.什么是基因诊断?常用的技术方法有哪些?

分子生物学论文

姓名:

专业:药学

班级:11级药学三班 学号:

基因工程抗体治疗白血病的研究进展

【摘要】目前采用基因工程药物治疗白血病逐渐成为热点。研究表明白血病在获得缓解后用基因工程药物治疗即可提高疗效,又可减轻化疗药物的毒副反应,并可望达到治愈白血病的目的。

【关键词】白血病;基因工程抗体;研究进展

1 引文

白血病是一类造血干细胞的克隆性疾病,在骨髓和其他造血组织中白血病细胞大量增生积聚,并浸润其他器官和组织,而使正常造血受抑制。在儿童至35岁以下青壮年人群中因患恶性肿瘤致死的以白血病为首,故可称为“第一杀手” [1]。治疗白血病通常采用细胞毒药物,虽然能使大部分患者病状缓解和生存期延长,但治愈率仍很低。基因工程技术的发展为降低单克隆抗体的免疫源性提供了一个有力的手段。目前嵌合抗体、人源化抗体和全人抗体三种人源抗体很好地克服了HAMA反应的缺陷。 2 正文

Campath一1H是在体内外对大部分正常和恶性淋巴细胞都有溶解杀伤作用的人源化CD52抗体,但对造血干细胞没有杀伤作用。起初,Campath一1H主要集中在对非霍奇金淋巴瘤(NHL)的临床试验中,但由于Campath一1H对血循环中的淋巴细胞有强力的清除作用,现已经将其应用到CLL、T— PLL疾病中。

氟达拉滨等嘌呤类似物在各种慢性淋巴细胞白血病的治疗中获得较高的缓解率,但完全根除疾病的报道很少。将Campath一1H给予预先接受氟达拉滨治疗的CLL患者,来清除微小残留病变(MRD),从而提高完全缓解率和持续时间,这可以使难治性CLL患者的总生存率(overall survival,OS)得到改善。Galimbeai[2] 等对8名CLL患者在氟达拉滨治疗后给予Campath一1H治疗。在Campath一1H治疗后,5例患者获得分子学缓解(62.5%),其中4例在治疗结束后一个月内获得。OR(overall response)率为72% ,CR率为43% ,因此Campath一1H对CLL的治疗作用是显著的。

另外,Keating[3]等 2002年对76例先前治疗过的T—PLL患者给予Campath—IH治疗的安全性和功效进行了回顾性的分析。接受Campath一1H治疗的患者,其OR率为51% ,CR为39.5% ,CR中位持续时间8.7个月,0s率为7.5个月(CR者14.8个月)。作者认为Campath一1H是补救T—PLL一线治疗失败__的较好药物。

在造血干细胞移植中,Campath一1H还能有效地清除供者的T淋巴细胞而不影响采集的干细胞的数目和功能,成为预防异基因移植中预防移植物抗宿主病(GVHD)较为理想的药物。

随着减轻强度的预处理(RIC)方案的发展,出现了“非清髓性”造血干细胞移植。这种方案主要是靠免疫活性细胞作用,目的是使供体干细胞既易于植入,又最终起到根除肿瘤的作用。通常是包括氟达拉滨等药物的联合应用,但仍然有较高的慢性GVHD的发生和死亡率。而Campath一1H能有效地清除供受者的T淋巴细胞,从而减少了排斥反应和GVHD的发生,为“非清髓性”移植提供了一种较为理想的免疫抑制效应。Faulkner[4] 等报道了65例接受BEAM+Campath一1H预处理方案进行异基因移植的患者,包括CLL、PLL,中位年龄为45.6岁。其中Campath—IH每天用10mg。11例发生了急性GVHD(I一Ⅱ),9例发生了慢性GVHD。55例获得了反应,其中41例为CR,6例复发。2年Os率为68.1% ,无事件生存率(EFS)为57.7%。结果2年移植相关死亡率(TRM)为13.3%。 3 结语

基因工程药物治疗白血病首先可以有效的避免治愈白血病过程中由于肿瘤的微小残留病变(MRD)不能被彻底清除而引起的疾病复发;其次是避免单纯化疗带来的毒副反应而引起机体的损伤以及机体对化疗药物的耐受性。因此用基因工程药物治疗白血病的方法成为了国内外科学家研究热点。我国与国外相比,虽起步较晚,但也获得了较大的发展,取得了一定的科研成果。例如,已经研制成功和正在研制的基因工程产品就有几十种,有些已经投产并开始使用,女ⅡIFN一、rhIL一

2、rhG—CSF、rhGM—CSF等。总之,基因工程药物治疗前景是十分诱人的,还有待于科研工作者的继续努力,让它为人类的健康作出更大的贡献。

【参考献文】

[1] 杨进.血液病中西医结合治疗学[M].北京:科学技术文献出版社,2005:65.

[2]Galimberti S,Cervetti G,Cecconi N,et a1.Quantitative molecular e.valuation of minimal residual disease in patients with chronic lym—phocytic leukemia:efficacy of in vivo purging by alemtuzumab(campath一1H)[J].J Immunother,2004,27(5):389—393.

[3]Keating MJ,Cazin B,Coutre S,et a1.Campatb一1H treatment of T—cell prolymphocytie leukemia in patients for whom at I east oneprior chemotherapy regimen has failed[J].J Clin Oncol,2002,20(1):205—213. [4] Faulkner RD,Craddock C,Byrne JI,et a1.BEAM—alemtuzumabreduced intensity allogeneic stem cell transplantation for lympho—proliferative diseases;GVHD,toxicity,and survival in 65patients[J].Blood,2004,103(2):428434.

SectionA 1 三个域:真细菌,古细菌,真核生物 2 组装中的主要作用力:非共价健作用力

SectionB 1 蛋白质纯化的分析方法

正电荷:天冬氨酸 谷氨酸

负电荷:赖氨酸 精氨酸

组氨酸

极性:天冬酰胺 谷氨酰胺

苏氨酸 丝氨酸 半胱氨酸

非极性:脂肪族 甘氨酸 丙氨酸 缬氨酸 亮氨酸

异亮氨酸 甲硫氨酸 脯氨酸

芳香族 苯丙氨酸

酪氨酸 色氨酸 Cys 二硫键 Gly 无手性 Pro 亚氨基酸

芳香族氨基酸最大吸收峰280mm 3 蛋白质的一级(决定蛋白折叠及其最后的形状的最重要的因素):氨基酸脱水缩合形成肽链 N端到C端

共价键

二级:多肽链中空间结构邻近的肽链骨架通过氢键形成的特殊结构。

α转角

β螺旋 氢键为主要作用力

三级: 多肽链中的所有二级结构和其他松散肽链区域(散环结构)通过各种分子间作用力(非共价键为主),弯曲、折叠成具有特定走向的紧密球状构象。

非共价键

四级: 许多蛋白分子由多条多肽链(亚基,subunits )构成。组成蛋白的各亚基以各种非共价键作用力为主,结合形成的立体空间结构即为四级结构。 非共价键

4 偶极:电子云在极性共价键的两原子间不均匀分布,使共价键两端的原子分别呈现不同的电性

兼性离子:具有正电荷(碱性),又具有负电荷(酸性)的分子 双极性分子:

Section C 1核酸的光学特性:

增色性:一种化合物随着结构的改变对光的吸收能力增加的现象 减色性:一种化合物随着结构的改变对光的吸收能力减少的现象 Reason: 碱基环暴露在环境中的越多,对紫外的吸收力越强 Absorbance(吸收值):Nucleotide > DNA/RNA > dsDNA 核酸的最大吸收峰260mm(碱基有芳香环) 芳香族氨基酸最大吸收峰280mm A260/A280:

纯的 dsDNA:1.8 纯的 RNA:2.0 纯的 Protein:0.5 2 Tm 值(熔解温度):热变性时,使得DNA双链解开一半所需要的温度。

Tm=2x(A+T) + 4x(G+C)

Tm值与DNA分子的长度,及GC的含量成正比

Annealing(退火):热变性的DNA经过缓慢冷却后复性

快速冷却: Stay as DNA

缓慢冷却: 复性成dsDNA 3 脱氧核糖核酸与核糖核苷酸得到画法

4 支持双螺旋结构的两个实验:查戈夫规则

X射线晶体衍射 5 双螺旋的内容:

双链之间的关系:DNA分子由两条链组成

双链反向平行 (5’3’ 方向)

两链的碱基通过氢键互补配对,A:T; G:C。

双链序列反向互补

各基团排列方式:糖磷酸骨架DNA分子排列在外;

碱基对平面相互平行,排列在DNA分子的内部。 空间结构为:右手双螺旋结构

每转一圈~10个碱基对,每一圈长度33.2A

双链螺旋中形成大沟,小沟。

6 碱对DNA的影响:高pH值对DNA的影响比低pH值的要小。

高 pH 值(pH>11)会改变碱基构象,使DNA变性(双链解旋,成单链)

RNA的影响:高pH值,2’羟基会攻击磷酸二酯键,使其断裂,形成2’,3’环式磷酸二酯键,从而使RNA分子断裂

7 共价闭合环状DNA (convalently closed circular DNA, cccDNA)。即通过共价键结合形成的封闭环状DNA分子。

8 超螺旋DNA(Supercoil DNA):松弛型双链DNA进一步旋转后,再形成闭环结构时,就会形成DNA超螺旋结构

L=T+W 判断是否为超螺旋 正负超螺旋

9 拓扑异构酶:暂时断裂DNA分子中一条或两条单链上的磷酸二酯键,改变DNA分子的连接数及拓扑状态。

功能:消除DNA复制和转录等过程产生的超螺旋。

细胞中,Ⅰ型酶与Ⅱ型酶的活性保持一种平衡状态。Ⅱ型酶的“使DNA超螺旋化” 与Ⅰ型酶“使DNA松驰化” 相抗衡,从而使DNA保持适当的超螺旋密度。

10 EB: 嵌入DNA配对碱基之间,使DNA分子在嵌入处局部解旋,增加ccDNA其它部位的正超螺旋

11 Type II RE

二型限制性内切酶:识别位点一般为4~8个碱基对的回文序列

如:EcoRI

5’GAATTC3’

3’CTTAAG5

Section D 1 染色体的折叠:串珠结构 :核心组蛋白:H2A, H2B, H3 and H4.

连接组蛋白 H1

核小体

30nm纤丝

高级环状结构(染色质的最高结构)

紧密缠绕结构

2 着丝粒:两侧是大量的名叫卫星DNA的重复序列

端粒:上百个短的重复序列

作用:端粒DNA 形成特殊的环状二级结构,保护染色体末端不被核酸外切酶降解。

抵消DNA复制时每一轮复制都导致两末端形成的后随链比母链要短一截的现象对染色体的影响

3 异染色质:高度浓缩,无转录活性

常染色质:结构松散,有转录活性

DNaseI 敏感区域:对区域内DNA的转录活跃

串珠结构

DNaseI 超敏感区域:转录活跃的基因的调控区域

DNA裸露 4 原核染色体结构:非特异性DNA结合蛋白:类组蛋白

位点特异性DNA结合蛋白:与特殊的DNA序列结合

有其他特殊的生理功能:RNA polymerases

对结构域的形成也很重要

56 复性动力曲线:

Low C0t: 高重复 卫星DNA Moderate C0t : 中重复 串联基因簇

反转座子 High C0t :单拷贝或低重复

大肠杆菌基因组

7 染色体结构对基因转录的影响

CpG 抑制→CpG位点中的胞嘧啶的C5常发生甲基化(CpG甲基化),CpG 甲基化可能可以DNA转录被限制→哺乳动物基因组中,有些区域含有很多未甲基化的CpG 位点,被称为CpG 孤岛。

甲基化—转录抑制

去甲基化—恢复转录

组蛋白的乙酰化:核心组蛋白N端的Lys被乙酰化,DNA与核心组蛋白体解聚。 Gene 表达被激活

去乙酰化:抑制 gene表达

组蛋白的磷酸化:对组蛋白 H1 磷酸化,抑制基因表达 其他组蛋白

8 中心法则

Section E 1 DNA复制:细胞中,一条双链DNA分子通过碱基配对,形成两条与其序列相同的DNA双链分子的过程。 2

确定DNA半保留复制

半不连续复制 3 复制的基本步骤 复制为双向

大肠杆菌的复制:

起始AT含量高的区域

参与蛋白:DnaA (复制起始因子):识别并结合于重复序列上,驱使富含AT的重复序列解链,需负超螺旋,及ATP

DnaB (DNA解旋酶):DNA双链解旋,形成复制叉

SSB:(单链结合蛋白):保持解旋部分的单链状态

DnaG(引发酶/引物酶):RNA引物合成,引发复制 延伸

参与蛋白:DNA Pol III全酶:负责新链的合成:前导链,冈崎片段

DNA pol

I:复制中除去引物,填补引物处空缺

终止:

4 真核生物的复制:

一个细胞周期内,一个DNA分子只能复制一次

Section F 1 复制忠实性的机制:

DNA复制的高精度:模板连和进入核苷酸在DNA聚合酶的作用位点正确配对

3’到5’外切核酸酶对错误碱基的校正

错配修复 2 holiday模型 3

Section K

1 编码链 模板链 2 大肠杆菌的转录

RNAP酶:核心酶:a 亚基:aNTD对核心酶的组装很重要。

aCTD在识别启动子、调节转录水平中起着非常重要的作用。

b 亚基:RNAP的催化中心。

与模板DNA、RNA产物、及底物核糖核苷酸紧密结合。

抗生素利福平结合在在b 亚基上,可以抑制RNAP的转录活性。

利福平只抑制转录的起始。

利迪链菌素只抑制延伸而不抑制转录起始

b’ 亚基:可能与RNAP的催化有关。

肝素与b’亚基结合后,能干扰RNAP与DNA的结合,抑制转录。

w 亚基:可能与RNAP的组装及维持RNAP结构的稳定性有关

s factor (s因子):s factor 在启动子特异性识别过程中至关重要 移动慢的原因:可以保持与翻译同步。

与有些基因转录调控相关。

有利于转录终止

RNAP没有3’ →5’外切酶活性,不能进行转录校正。其错配率达104。RNAP倒退暴露新合成的错配碱基,可以有利于其他辅助核酸酶将错配碱基切除,增加转录的忠实性。

3 s70基础启动子的一般结构

10 序列:它对转录起始时,RNAP打开DNA双链的过程非常重要。

10序列到TSS位点的距离对转录效率也有很大的影响 35 序列:增强RNAP s factor 的识别能力及与DNA的结合能力 4 影响启动子效率的DNA序列:

核心启动子的序列:与保守序列越像,效率越高。

TSS周围序列:影响起始效率。

转录单位的前30个核苷酸的碱基序列:影响RNAP从启动子处移动出去(启动子区清空)的速率。

核心启动子附近的调控元件。

5 转录的起始:开放复合物 闭合复合物 无效起始

延伸:启动子的清空,链的延伸转录泡,s因子的循环利用

终止:依赖性 不依赖性

反复重复序列

Section L 1.顺式作用元件(cisacting elements) :一般为DNA上较为保守的、有着特异性序列或结构的特定区域。它们只能影响与其在同一条染色体上的基因的活动。 如:启动子,转录激活因子结合位点等。

反式作用基因/调节基因(transacting genes,regulator genes)

可以影响与他们不在同一条染色体上的基因的表达水平的DNA元件。 2 乳糖操纵子

3 色氨酸操纵子

4 正负调控都可以有诱导和阻遏两种调控方式。

正控诱导:诱导因子活化激活因子,使其可以增加基因的表达。(Lac operon, CRP调控) 正控阻遏:共阻遏物使激活因子失活,减少基因的表达。 负控诱导:诱导因子使阻遏蛋白失活,增加基因的表达。(Lac operon,lac repreor) 负控阻遏:共阻遏物活化阻遏蛋白,使其可以降低基因的表达。(Trp operon, trp repreor)

Section M

1 增强子 沉默子

2 TFIID:可与多种核心启动子元件或特异性转录因子结合,启动二类转录预起始复合物组装的通用转录因子。

TBP (TATAbox binding protein):可识别并结合TATAbox TAFII(TBPaociated factor II):TBP关联蛋白,TFIID中与TBP形成复合体的所有蛋白,~13个。

TFII H的结构与功能:蛋白激酶 (4 个亚基):催化蛋白磷酸化。将NTP(一般为ATP)的g磷酸基团转移到蛋白上。

磷酸化 RNA pol II 中的CTD 结构域。 TFIIE 刺激TFIIH介导的磷酸化反应。 DNA 解旋酶/ATPase (5 亚基):

水解ATP,利用其能量打开DNA的双链

3 TBP (TATAbinding protein): 确保 RNA Pol I能正确定位到转录起始区域上。

SP1 为组成性表达的转录因子,在所有的细胞中都存在,与基因本底表达水平有关 SL1,选择因子,RNA Pol I起始转录所必需的因子 CTD:羧基末端结构域,

的磷酸化状态与转录进程有关

转录起始时期,CTD结构域一般处于去磷酸化形式 ,与结合启动子有关。

转录延伸时期,CTD结构域常处于磷酸化形式,与mRNA的加工有关。

Section N 1 DNAbinding domains(DBD):DNA结合结构域

螺旋转角螺旋结构(域)

锌指结构(域)

碱性结构(域)

Dimerization domains:二聚体化结构域

亮氨酸拉链 螺旋 散环 螺旋 DBD+DM 激活结构域 酸性激活结构域 富含谷氨酰胺结构域 富含脯氨酸的结构域 LBD

Section O

1 真核生物中mRNA 加工的一般过程 5’加帽: CTD作用:转录起始时,参与加帽反应的三种酶结合在RNA Pol II的CTD结构域上。转录产物刚开始合成时,即对其5’端进行加帽反应。

作用:防止降解:核糖核酸酶一般不能降解帽结构中的三磷酸键

帮助转运mRNA到细胞质中

增强翻译水平:mRNA需要帽结合蛋白的帮助才能更好的与核糖体结合

帮助去除premRNA中的第一个内含子。 3’加Poly (A)尾:

作用:防止被核酸酶降解:增加mRNA的稳定性

有助于mRNA从细胞核到细胞质的转运

参与premRNA的最后一个内含子的剪接。

增强mRNA的翻译水平,增加基因的表达 剪接 甲基化 2 核酶有:有催化功能的RNA即为核酶

U2 U6 RNAP 3 RNA的多样性:可变加工,反式剪接,RNA编辑

4 原核生物核糖体

真核生物核糖体

5 原核rRNA 加工的大致过程:形成多个茎环结构,与蛋白结合形成RNP,核苷酸修饰,逐级切割

真核rRNA 加工的大致过程:甲基化,切割。内含子剪接

6 原核tRNA 加工的大致过程:将多顺反子前体切割,分离出单顺反子前体

单顺反子前体进一步被切割,形成与成熟tRNA长度一致分子( RNases D, E, F,P

.碱基修饰,形成成熟tRNA 真核tRNA 加工的大致过程:5’末端成熟,3’末端成熟(添加5’CCA3’)去除内含子 7 miRNA and siRNA的调控机制:mRNA降解,抑制翻译,抑制转录

Section P 1 遗传密码的特性:

蛋白的编码信息由三联体密码子组成。

密码子为连续的,之间无间隔、无重叠。

除三个终止密码子之外,每个密码子对应一种氨基酸

有密码简并现象。即:多个密码子对应同一种氨基酸。

标准遗传密码子在各类生物中基本通用,不过少数生物体或细胞器中,有一些密码子对应的氨基酸与标准的不同。

生物对同义密码子的使用经常有偏好性。不同生物的密码子偏好性不同。

基因一般不重叠。一段核酸分子一般只有一个开放阅读框(open reading frame, ORF/可读框),被翻译成一个蛋白。

有些物种也有重叠基因的现象。

2 开放阅读框:ORF 从起始密码子ATG 到终止密码子

TGA,TAA or TAG 之间的连续的蛋白编码序列

CDS 编码序列 当ORF可以预测一个蛋白时 3 tRNA 二级结构:三叶草结构 4 tRNA的特异性加载:(翻译的高保真性)

氨酰tRNA合成酶对相应tRNA分子有很强的专一性:第二密码子:

氨酰tRNA合成酶接受相应氨基酸时有很强的忠实性:校正:双筛选机制—酶的活性中心,酶中的编辑位点

5 氨酰tRNA (AAtRNA) : 3’end加载了一个氨基酸的tRNA分子。是在蛋白质合成中,将密码子转换氨基酸的适配器。

Section Q 1 密码子与反密码子的反向互补配对

2 一个tRNA可识别的密码子数由反密码子的第一位碱基决定

摆动学说:第三位密码子与第一位反密码子的配对可以摆动

反密码子第一位为A或C时,配对无摇摆现象。 3 核糖体的E,P,A位点 A位:接受AAtRNA部位.

除了起始氨酰tRNA,其他所有AAtRNA都只能进A位点。 P位:肽酰基tRNA结合部位。起始氨酰tRNA也进入此位点。 E位:空载tRNA离开核糖体的位点。 4 核糖体各亚基的功能

核糖体小亚基功能:结合mRNA

促进密码子与反密码子的正确结合

mRNA移位

大亚基的功能A位、P位、肽酰转移酶(转肽酶)中心等在大亚基上。

负责携带AAtRNA、肽键/肽链的形成 5 翻译的基本内容 核糖体与mRNA结合

氨酰tRNA逐个进入核糖体

氨酰tRNA通过反密码子与mRNA互补配对 氨酰tRNA分子的氨基酸之间形成肽键。 空载tRNA的释放 肽链的释放

分子生物学学习心得

生命科学发展日新月异,特别是微观生物学的发展速度可谓惊人。作为一名本科生,最重要的就是掌握好基础知识,为今后的科研工作或是研发工作打下基础,这样才能跟得上知识和信息发展的脚步。分子生物学作为微观生物学的根基,学好它无疑将为将来的发展打下最坚实的基础。

最近我读了一篇文献,是有关不同类型的弥散性大B细胞淋巴瘤的基因表达分析的。弥漫型大B细胞淋巴瘤(DLBCL),最常见的非霍奇金淋巴瘤亚型,是在临床上异构的:40% 的患者目前的治疗反应良好,长期生存,而其余屈服于疾病。我们认为这种可变性在自然历史反映了识别分子在肿瘤异质性。两个不同的分子形式的DLBCL有着不同的gene表达模式,表明了B细胞有不同的分化阶段。一种是表达中心B细胞的基因表达特征(中心B细胞类似DLBCL),另一种是表达体外激活诱导外周血B细胞(激活B细胞类似DLBCL)。其中中心B细胞的存活率大于激活B细胞。我们发现肿瘤的分子分类的基础上的基因表达可以识别以前未被发现和临床癌症的重要亚型。构建了一个特异性的DNA微阵列,分析淋巴恶性肿瘤的基因表达,判断基因表达模型和肿瘤表型,最后利用分层系统树图得出结论。

从文献中我了解了DNA微阵列技术,掌握了DNA微阵列技术的方法,学会了分析分层系统树图,更认识到了弥漫型大B细胞淋巴瘤(DLBCL)研究的重要性。分子生物学是一门前沿的学科,我们只有努力学习英语,经常阅读中外文献,亲自参与到实验中去,才能了解分子生物学最新的研究成果,掌握分子生物学中的研究分析方法。

通过一个学期的分子生物的学习,第一,我掌握了以中心法则为核心的最基本的分子生物学知识

了解了基因表达调控的基本原理

锻炼了专业英语阅读和写作能力,也 接触了微观生物学前沿,培养了一定的科研思维能力。学习分子生物学提高了我们的微观生物学素养,为今后的进一步学习打下了坚实基础,同时了解了最新的微观生物学进展,让我们对生物学科研有了一定的感性认识。

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